不同強度運動對腦缺血再灌注大鼠學習能力及氧自由基代謝的影響①

孫竹梅，趙雅寧，李建民，陳長香，趙旭，陳乃玲

不同強度運動對腦缺血再灌注大鼠學習能力及氧自由基代謝的影響①

孫竹梅1，趙雅寧1，李建民1，陳長香1，趙旭1，陳乃玲2

目的探討不同強度運動對全腦缺血再灌注大鼠學習能力及海馬區氧自由基代謝的影響。方法60只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分成假手術組(n=15)、全腦缺血再灌注組(n=15)、有氧運動預處理組(n=15)、力竭運動預處理組(n=15)。分別在術后1 d、3 d、7 d，HE染色觀察海馬區神經細胞形態變化，穿梭箱評測大鼠學習能力，羥胺法測定大鼠腦組織海馬區超氧化物歧化酶的活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛水平。結果與假手術組比較，其他各組存活的神經元數目、主動回避反應率、超氧化物歧化酶活性顯著降低(P＜0.001)，被動回避潛伏期、丙二醛水平顯著升高(P＜0.001)。其中，全腦缺血再灌注組存活的神經元數目、主動回避反應率及超氧化物歧化酶的活性顯著低于有氧運動預處理組(P＜0.001)，顯著高于力竭運動預處理組(P＜0.001)，被動回避潛伏期及丙二醛水平顯著高于有氧運動預處理組(P＜0.001)，低于力竭運動預處理組(P＜0.001)。結論規律的有氧運動有利于保護腦缺血大鼠的學習能力，而力竭運動則產生負面影響，可能與運動對氧自由基代謝的調節有關。

腦缺血再灌注；學習；有氧運動；力竭運動；氧自由基；大鼠

[本文著錄格式]孫竹梅，趙雅寧，李建民，等.不同強度運動對腦缺血再灌注大鼠學習能力及氧自由基代謝的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):26-30.

CITED AS:Sun ZM,Zhao YN,Li JM,et al.Effect of intensity of exercise on learning ability and oxygen free radical metabolism in rats after cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):26-30.

腦缺血性疾病以其高致殘率、高致死率、高發病率嚴重威脅著人類健康，它所導致的運動功能障礙及學習能力減弱已逐漸成為醫學界研究的重點[1-2]。國內外越來越多的研究發現，運動可明顯改善大腦的神經功能，提高學習能力[3-4]。然而，運動與學習能力的關系尚存爭議。Leite等發現，有規律的運動訓練可促進神經保護作用[5]；而Vi?a等認為，持久的高強度運動產生過量的氧自由基，增加人體脂質過氧化、谷胱甘

肽氧化和氧化蛋白的破壞，并造成中樞神經細胞凋亡數量增加[6-7]。本研究檢測不同強度運動對全腦缺血再灌注大鼠海馬區學習能力的變化，并從氧自由基代謝的角度探討其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠60只：北京維通利華公司，合格證號SCXK(京)2003-003。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。ZH-PT型計算機控制動物實驗跑臺、ZH-CSC型穿梭實驗視頻分析系統：安徽正華生物儀器設備有限公司。752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。恒溫水浴箱：江蘇省金壇醫療儀器廠。5417R冷凍離心機：德國Eppendorf公司。旋渦混勻器：江蘇海門市麒麟醫用儀器廠。

1.2 動物分組和模型制備

大鼠采用隨機數字表法分成假手術組(A組，n= 15)、全腦缺血再灌注組(B組，n=15)、有氧運動預處理全腦缺血再灌注組(C組，n=15)、力竭運動預處理全腦缺血再灌注組(D組，n=15)，每組又平均分為1 d、3 d和7 d時間亞組。

A組分離暴露血管，不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈；B、C、D組應用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-vessel occlusion,4-VO)法[3]制備全腦缺血模型。動物術前12 h禁食，常規水合氯醛麻醉，頸正中切口，分離出雙側頸總動脈，在其下置線備用。將大鼠翻正并用立體定位儀固定頭頸部，枕后部正中切口，暴露雙側第一頸椎橫凸翼孔，直視下電凝椎動脈，每次電凝2～4 s，使其永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠，24 h后以無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，10 min后松開動脈夾。

參照國內外文獻[6,8-9]，C、D組于造模前每日9:00開始跑臺運動，跑臺坡度0°。先進行適應性跑臺訓練7 d，分別以10 m/min、15 m/min、20 m/min的速度持續10 min，待大鼠熟悉跑臺設備并能以20 m/min的速度持續跑30 min后，C組每天以20 m/min運動30 min (相當于30%最大耗氧量)，D組采用遞增方式進行運動，開始速度為10 m/min，逐漸在3 min內達到19.3 m/min(相當于70%最大耗氧量)，保持速度直至力竭。判斷力竭的標準：大鼠跑姿由蹬地式變為伏地式，神情倦怠，呼吸急促，滯留在跑道后1/3處3次以上，聲波和光刺激驅趕無效，電刺激大鼠尾部仍跟不上預定速度。兩組均持續14 d。運動預處理后立即制備成全腦缺血再灌注模型。

1.3 穿梭實驗

采用ZH-CSC型穿梭實驗視頻分析系統(Shuttle box system)。穿梭箱內部250×185×300 mm，底部設不銹鋼柵欄，使用電流作為非條件刺激，電擊動物足底部。頂部設噪聲發生器(鈴聲)作為條件刺激。大鼠分別于術后1 d、3 d、7 d放入穿梭箱，適應5 min消除探究反射后予鈴聲刺激5 s，繼予電擊30 s，間隔20 s后進入下一輪。若在鈴聲刺激5 s內大鼠逃向安全區，則為主動回避反應，系統自動停止當次訓練；如果在鈴聲刺激5 s內大鼠未逃向安全區，則給予1.5 mA交流電30 s，在電擊后逃向安全區為被動回避反應陽性，否則為主動、被動回避反應陰性。每只大鼠電擊30次，系統自動記錄遭受電擊時間(被動回避潛伏期,passive avoidance latency,PAL)、主動回避反應次數等參數。主動回避反應次數占總訓練次數的百分比即為主動回避反應率(active avoidance reaction rate, AARR)。學習成績用主動回避反應率和被動回避潛伏期評價。

1.4 HE染色

術后1 d、3 d、7 d，各組大鼠10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛心臟灌流，斷頭取腦，切取約2 mm厚冠狀背側海馬，立即以4℃4%多聚甲醛固定。24 h后常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片與貼片，切片厚4 μm；45℃恒溫箱烤干，常規脫蠟、脫水，蘇木素及伊紅染色，中性樹膠加蓋玻片封固。在光學顯微鏡(40×10)下觀察神經元形態變化。每只動物取6張海馬CA1區切片，Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統計數高倍視野下的存活與壞死的神經細胞數，取均值。

1.5 SOD、MDA檢測

按時間點將各組大鼠處死后，迅速取雙側海馬區組織，稱重，加冰鹽水制成5%組織勻漿，取上清，依次加入SOD檢測試劑，旋渦混勻器混勻，37.5℃水浴40 min，冷卻，加入顯色劑。利用725分光光度儀，波長調至550 nm處，將配好的試劑放進1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測定各管吸光度值，按說明計算SOD含量。

同法處死大鼠取材并加入MDA檢測試劑，旋渦

混勻器混勻，試管口用封口膜扎緊，針頭刺一小孔，95℃水浴40 min，流水冷卻，3500～4000 r/min離心10 min。取上清，利用725分光光度儀，波長調至532 nm處，將配好的試劑放進1 cm光徑比色杯，用蒸餾水調零，測定各管吸光度值，按說明計算MDA含量。

1.6 統計學分析

采用Excel建立數據庫，應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。數據以(±s)表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 形態學

A組大鼠海馬區神經元細胞形態飽滿，排列整齊緊密，胞核規則，核仁清晰。B組神經元細胞出現核固縮、深染，部分神經元胞核完全消失，形成空泡狀結構。C組存留部分形態正常神經元細胞，壞死神經元細胞減少，神經細胞固縮深染現象減輕。D組神經細胞破壞嚴重，可見較多壞死神經細胞失去正常形態，出現胞核與胞質界限不清、核固縮、深染現象(圖1)。圖像分析結果顯示，與A組比較，其他各組各時間點神經元壞死率較高(P＜0.05)；其中B組神經元壞死率高于C組(P＜0.05)，低于D組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠海馬區神經元細胞壞死率比較(%)

圖1 各組大鼠缺血3 d后海馬區CA1區神經元(HE染色，400×)

2.2 穿梭實驗

與A組相比，其他各組各時間點AARR均降低，APL明顯延長；D組較B組自發運動量進一步下降，對電擊刺激反應遲鈍；C組較B組反應靈敏，能夠多次有效躲避電擊。B組AARR低于C組，高于D組，APL時間高于C組，低于D組(均P＜0.05)。見表2。

2.3 SOD和MDA

與A組相比，其他各組各時間點SOD活性明顯降

低，MDA活性明顯升高；B組SOD活性明顯低于C組，高于D組；MDA活性高于C組，低于D組(均P＜ 0.05)。見表3。

表2 各組大鼠穿梭實驗結果比較

表3 各組大鼠SOD和MDA比較(nmol/mg)

3 討論

學習能力是大腦主要的高級神經功能之一，是人和動物生存發展的重要功能。缺血性腦疾病常導致患者出現學習功能障礙，延遲其功能恢復，加重癡呆。運動療法以其簡單易行性、普遍性以及與學習能力的密切關聯被醫學界廣泛認可，然而運動的強度仍是廣大學者關注和研究的熱點。

本研究顯示，力竭運動會加重腦缺血后海馬區神經元細胞的死亡，并導致學習能力下降；而有氧運動會促進神經元細胞再生，使缺血再灌注大鼠的學習能力提升。說明有氧運動能改善缺血后神經元細胞的功能及神經元發生水平，有利于學習能力的維持，與國外學者研究結果一致[10-11]。Ramsden等發現，大鼠以10 km/d的強度持續15 d能夠減緩神經元丟失，但以超過12 km/d的強度持續15 d后，卻加速神經元的丟失[12]。本研究也發現，持久的大強度運動(19.3 m/min,3 h)會導致缺血再灌注大鼠海馬區神經元細胞進一步丟失與退化，影響神經功能的恢復并減退其學習能力。提示在臨床工作中，我們應指導人們選擇合適的運動強度進行有氧訓練，切勿急于求成。

氧自由基在腦缺血后神經元損傷中起著至關重要的作用。氧自由基增加導致脂質、蛋白質和DNA氧化損傷，加劇腦缺血再灌注過程中的組織學損傷[13]。姜招峰等發現，海馬及皮質氧自由基損傷的大鼠，學

習記憶能力較正常大鼠低下[14]。本研究顯示，力竭運動造成腦缺血再灌注大鼠海馬區SOD活力下降，MDA含量增加，加重氧自由基損傷；而有氧運動與之相反，能提高機體清除氧自由基及腦細胞抗氧化的能力。國內外學者發現，有氧運動預處理能夠通過促進腦組織氧化性損傷的減少、增強抗氧化活性來改善腦缺血帶來的運動功能障礙和腦損傷；而長期超負荷運動，由于蛋白質分子的氧化修飾及運動過程中活性氧產生增多，誘導產生氧化應激，并通過缺血后腦細胞凋亡參與缺血損傷，使認知功能下降對其學習記憶功能有明顯損害[13,15-16]。與本研究基本一致。

本研究顯示，規律的有氧運動通過維持腦缺血動物神經細胞正常形態及功能、調控氧自由基代謝，能促進腦缺血再灌注后學習能力的恢復。提示運動訓練應遵循適量、適度原則，不能忽略氧自由基積累的后果，以免加重腦缺血后進一步損傷以及疾病的康復。

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Effect of Intensity of Exercise on Learning Ability and Oxygen Free Radical Metabolism in Rats after Cerebral Ischemia-reperfusion

SUN Zhu-mei,ZHAO Ya-ning,LI Jian-min,CHEN Chang-xiang,ZHAO Xu,CHEN Nai-ling.Rehabilitation and Nursing College,Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China

Objective To explore the effetc of different intensity of exercise on learning ablility and oxygen free radical metabolism in rats after cerebral ischemia-reperfusion(I/R).Methods 60 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,I/R group, aerobic exercise preconditioning group and exhaustive exercise preconditioning group.The morphological changes of neural cells in hippocampus were observed with HE staining,the learning ablility was assessed with shuttle box,the activity of superoxide dismutase and malondialdehyde level in hippocampus were measured with hydroxylamine method and TBA method respectively 1,3,7 days after injury.Results The number of survival neurons,active avoidance reaction and activity of superoxide dismutase decreased,and the latency of passive avoidance and malondialdehyde levels increased in all the other groups compare with the sham group(P＜0.001).Further more,the number of surviving neurons,active avoidance reaction rate and the activity of superoxide dismutase were less in the I/R group than in the aerobic exercise preconditioning group(P＜0.001),and more than in the exhaustive exercise preconditioning group(P＜0.001),while the latency of passive avoidance and the level of malondialdehyde was more than in the aerobic exercise preconditioning group(P＜0.001),and less than in the exhaustive exercise preconditioning group(P＜0.001).Conclusion Regular aerobic exercise is beneficial to protect the learning ability from cerebral I/R in rats,but exhaustive exercise may be negative,which may associated with the metabolism of oxygen free radical in hippocampus impacted by exercise.

cerebral ischemia-reperfusion;learning;aerobic exercise;exhaustive exercise;oxygen free radical;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.007

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0026-05

2014-07-31

2014-09-01)

河北省教育廳重點資助項目(No.ZH2012046)。

1.河北聯合大學康復醫學院，河北唐山市063000；2.河北聯合大學口腔醫學院，河北唐山市063000。作者簡介：孫竹梅(1988-)，女，漢族，河北唐山市人，碩士研究生，主要研究方向：腦創傷與腦保護。通訊作者：李建民，男，博士，教授。E-mail:zyning789@126.com。