椎板切除神經根損傷后聚羧甲基葡萄糖胺產品抗瘢痕粘連的效果①

蘇迪婭，劉松，王世煒，歷俊華，崇逢，李東風，李睿智，萬虹

椎板切除神經根損傷后聚羧甲基葡萄糖胺產品抗瘢痕粘連的效果①

蘇迪婭1，劉松1，王世煒1，歷俊華1，崇逢2，李東風2，李睿智2，萬虹1

目的探索聚羧甲基葡萄糖胺產品防止神經損傷后瘢痕粘連形成的效果。方法48只雄性Sprague-Dawley大鼠分為A、B兩組。大鼠切除L4-5椎板，暴露并損傷右側神經根。A組術區涂抹生理鹽水，B組涂抹聚羧甲基葡萄糖胺產品。術后第1 (A1、B1)、2(A2、B2)、4周(A3、B3)對各組神經根周圍粘連行Rydell評分；HE染色、Masson染色觀察，行粘連組織學Nussbaum評分；檢測血常規和肝、腎功能。結果各組Rydell評分：A1組Ⅰ級、A2組Ⅱ級、A3組Ⅲ級，B1組0級、B2組0級、B3組Ⅱ級。HE染色示B組較A組神經根周圍粘連速度慢且瘢痕生長疏松。Masson染色示B組較A組神經根周圍瘢痕組織網稀疏散在，且隨時間延長其致密程度加深不明顯。組織學Nussbaum評分示，同時段A、B組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。各組大鼠血常規及肝、腎功能均在正常參考值范圍內。結論聚羧甲基葡萄糖胺產品能有效防止椎板切除術后神經根周圍及硬膜外瘢痕粘連形成，無毒副作用。

聚羧甲基葡萄糖胺；椎板切除術；神經根；瘢痕；粘連；大鼠

[本文著錄格式]蘇迪婭，劉松，王世煒，等.椎板切除神經根損傷后聚羧甲基葡萄糖胺產品抗瘢痕粘連的效果[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):45-48.

CITED AS:Su DY,Liu S,Wang SW,et al.Effect of a chitosan product on scarring and adhesion of injured nerve after laminectomy[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):45-48.

椎板切除術是脊柱外科常用的術式之一。椎板切除術后，在椎板缺損處可形成瘢痕組織，與硬膜及神經根周圍粘連，最終壓迫、牽拉神經根而引起腰腿疼痛，嚴重影響手術的長期效果，同時為再次手術增加了困難和風險。我們依據聚羧甲基葡萄糖胺的理化性質和瘢痕形成原理，觀察聚羧甲基葡萄糖胺產品對椎板切除術后抗瘢痕粘連的效果，探討聚羧甲基葡萄糖胺產品在神經外科領域中抗瘢痕粘連的有效性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備

聚羧甲基葡萄糖胺產品由北京愛美客生物科技有限公司提供。K型電子天平：美國雙杰兄弟有限公司。AXTOV-mRC數字信號采集分析系統：尼康影像儀器銷售有限公司。RM2235手動輪轉式切片機、M400-E手術顯微鏡、EG1150H加熱石蠟包埋系統：德國LEICA公司。Masson染色試劑盒：北京益利精細化學品有限公司。

成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重200～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 模型制作及動物分組

實驗動物稱重，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉。大鼠取俯臥位，固定頭部及四肢，腹部墊棉墊使脊柱輕度背弓。背部術區備皮，0.5%碘伏消毒。鋪無菌洞巾。觸摸肋弓定位，以L4棘突為中心，作脊柱正中切口，長約5.0 cm，切開皮膚、背部筋膜，鈍性剝離骶棘肌，暴露L4-5椎板，自上而下切除L4-5椎板，暴露并損傷硬脊膜及同節段右側神經根，壓迫止血。

動物分為兩組：A組以棉片浸透生理鹽水，B組以聚羧甲基葡萄糖胺產品涂抹在神經根和硬脊膜表面。A組3 min后取出棉片，以生理鹽水沖洗切口3次；B組待液態聚羧甲基葡萄糖胺凝聚為膠體狀態后，逐層縫合手術切口。術后動物按組分籠飼養。所有大鼠術前、術后喂養及管理條件一致。根據觀察時間不同，A、B兩組又各分為3個亞組(n=8)：A1組與B1組為術后1周觀察組、A2組與B2組為術后2周觀察組、A3組與B3組為術后4周觀察組。

1.3 Rydell評分

術后每天觀察動物的活動情況。在術后1、2、4周取相應亞組內3只大鼠戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，完整切取手術節段脊柱，觀察硬膜外粘連情況。參考Rydell等制定的評分標準[1]，將硬膜外及神經根周圍粘連程度分為4級：0級，硬膜和神經根與瘢痕組織或移植物無明顯粘連；Ⅰ級，硬膜和神經根外有稀疏而散在的膜性粘連，瘢痕組織或填充物易與硬膜鈍性分離；Ⅱ級，硬膜和神經根與瘢痕組織粘連較廣泛和致密，鈍性分離阻力較大，分離后硬膜仍保持完整；Ⅲ級，粘連廣泛、致密，硬膜和神經根與瘢痕無法鈍性分離，銳性分離后的硬膜難以保持完整。進行Rydell評分。

1.4 標本制備

術后1、2、4周，取相應亞組內5只大鼠，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注，完整切取手術節段脊柱，4%多聚甲醛室溫固定24 h，30%甲酸室溫脫鈣5 d，清水沖洗1 d后浸蠟，包埋，石蠟切片，片厚4 μm。選取鄰片分別進行HE染色與Masson染色。

1.5 HE染色

石蠟切片脫蠟入水，染色，脫水透明，封片。由3名對分組情況不知情的專業人員對各組粘連程度按照改良Nussbaum標準[2]進行組織學評分：0分，無粘連；1分，少量粘連；2分，中量粘連；3分，大量粘連。

1.6 Masson染色

石蠟切片脫蠟入水，染色，先入蘇木精染液，鹽酸酒精分色后用Masson染色盒進行4種染液(麗春紅-酸性復紅液、磷鉬酸溶液、亮綠溶液、冰醋酸水溶液)逐一滴染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.7 血常規及肝、腎功能檢測

每組分別取5只大鼠，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，真空采血管心臟取血3 ml，送檢驗科檢測肝腎功能和血常規。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Rydell評分

A1組有稀疏而散在的膜性粘連，Rydell評分Ⅰ級；B1組未見纖維粘連，未形成瘢痕組織，Rydell評分0級。A2組瘢痕粘連較A1組有所增加，硬膜與瘢痕組織粘連較廣泛和致密，鈍性分離阻力較大，分離后硬膜仍保持完整，Rydell評分Ⅱ級；B2組未見明顯纖維粘連，Rydell評分0級。A3組有明顯纖維瘢痕粘連，用利器難以分離，Rydell評分Ⅲ級；B3組硬膜外有稀疏而散在的膜性粘連，瘢痕組織或填充物易與硬膜鈍性分離，Rydell評分Ⅱ級(圖1)。

2.2 HE染色

光鏡下神經組織與瘢痕纖維均呈粉紅色，細胞核藍染。A1組神經根與脊髓表面粘連少量而松散；B1組神經根表面基本無粘連。A2組神經根與脊髓表面粘連較A1組稍致密，但致密度不高；B2組神經根與脊髓表面粘連少量而松散。A3組神經根周圍可見致密纖維組織包裹；B3組神經根與脊髓表面粘連有稀疏的纖維組織(圖2)。A組和B組同時段大鼠神經根與脊髓周圍的粘連程度Nussbaum評分均存在顯著性差異

(P＜0.05)。見表1。

2.3 Masson染色

脊髓組織與神經根組織呈紅色，瘢痕組織呈藍綠色。與鄰片HE染色同時觀察，A1組神經根與脊髓表面粘連少量，可見藍綠色粘連呈網狀，且網狀結構較松散；B1組神經根表面基本無粘連。A2組神經根與脊髓表面粘連較A1組稍致密，網狀結構中白色部分明顯減少；B2組神經根與脊髓表面粘連少量而松散，綠色粘連呈絮狀結構。A3組神經根周圍可見致密纖維組織包裹；B3組神經根與脊髓表面有稀疏的綠色網狀結構(圖3)。

表1 術后各組瘢痕粘連程度Nussbaum評分比較

圖1 各組大體解剖學觀察(25×)

圖2 各組HE染色觀察

2.4 血常規及肝、腎功能檢測

各組大鼠的血常規及肝、腎功能檢測值均在正常范圍內。見表2。

表2 各組血常規及肝腎功能比較

3 討論

椎板切除術是脊柱外科常見的術式之一，常用于腰椎間盤突出癥、脊柱腫瘤和椎管減壓等。術后在傷區會發生一系列復雜的生物學反應：細胞浸潤，中性粒胞聚集，巨噬細胞數量增多，成纖維細胞合成膠原與基質量增加，早期為肉芽組織，晚期形成瘢痕。

對于椎板切除后瘢痕粘連成因說法多樣，得到最多認可的是Songer等提出的“三維立體學說”[3]。他們研究發現，硬膜周圍的纖維化既來自后方損傷的骶棘肌，也來自前方損傷的纖維環和后縱韌帶。還有研究認為，纖維化形成過程中，血腫和炎癥反應也起到非常重要的作用。根據以上理論，我們認為，三維立體包繞神經根及硬膜，使它們與周圍組織達成某種程度物理隔離，同時又存在抗炎、止血效果的抗瘢痕粘連產品效果最佳。

聚羧甲基葡萄糖胺又名羧甲基殼聚糖，具有抑制成纖維細胞生長并減少膠原纖維合成的作用。此外，聚羧甲基葡萄糖胺還具有一定的生物活性，如止血[4]、抗感染[5]、提高免疫活性、減少瘢痕組織形成[6]等。聚羧甲基葡萄糖胺的降解產物主要為羧甲基葡萄糖胺，安全、無毒副作用[7]。

本實驗中由北京愛美客生物科技有限公司提供的聚羧甲基葡萄糖胺產品還具有獨特的生物學優勢。此產品由雙聯注射器和封裝在雙聯注射器中的溶液組成。雙聯注射器中溶液主要由聚羧甲基葡萄糖胺及雙重交聯劑配制而成。雙聯注射器中溶液經雙聯注射器推出，混合均勻后，混合溶液初始呈流動狀態，且具有一定黏附性；在化學、物理雙交聯作用下，可在40 s內原位形成凝膠膜。該凝膠柔軟而有彈性，且具有一定的抗壓能力及拉伸強度，符合防粘連材料的臨床要求；凝膠pH值及滲透壓均接近體內組織環境，符合防粘連材料的安全性要求；凝膠仍保留聚羧甲基葡萄糖胺抑制成纖維細胞生長并減少膠原纖維合成的作用，符合防粘連材料的生物活性要求。不會發生失水，溶脹性較小，且溶脹后仍保持柔軟狀態，不影響效果；成膠阻隔效果不受組織液及血液存在的影響；凝膠膜柔軟有彈性，不會壓迫神經；凝膠膜具有一定的抗壓能力及拉伸強度，不會因組織縫合過程中的牽拉而斷裂，不會因組織間的壓力而碎裂。

本研究顯示，此聚羧甲基葡萄糖胺產品可有效防止椎板切除術后瘢痕粘連形成，對實驗動物無毒副作用。該產品操作簡單、便捷，有望成為臨床有效、實用的抗神經粘連產品。

[1]Rydell N,Balazs EA.Effect of intra-articular injection of hyaluronic acid on the clinical symptoms of osteoarthritis and on granulation tissue formation[J].Clin Orthop Relat Res,1971, 80:25-32.

[2]Nussbaum CE,McDonald JV,Baggs RB.Use of Vicryl(polyglactin 910)mesh to limit epidural scar formation after laminectomy[J].Neurosurgery,1990,26(4):649-654.

[3]Songer MN,Ghosh L,Spencer DL.Effects of sodium hyaluronate on peridural fibrosis after lumbar laminotomy and discectomy[J].Spine(Phila Pa 1976),1990,15(6):550-554.

[4]Rajiv S,Harding M,Bassiouni A,et al.The efficacy and safety of chitosan dextran gel in a burr hole neurosurgical sheep model[J].Acta Neurochir(Wien),2013,155(7):1361-1366.

[5]葉磊,何立千,高天洲,等.殼聚糖的抑菌作用及其穩定性研究[J].北京聯合大學學報:自然科學版,2004,18(1):79-82.

[6]曾德強,陳雙,楊斌.殼聚糖膜預防術后腹腔粘連及其作用機制的研究[J].嶺南現代臨床外科,2005,5(2):94-96.

[7]Kean T,Thanou M.Biodegradation,biodistribution and toxicity of chitosan[J].Adv Drug Deliv Rev,2010,62(1):3-11.

Effect of A Chitosan Product on Scarring and Adhesion of Injured Nerve after Laminectomy

SU Di-ya,LIU Song,WANG Shi-wei,LI Jun-hua,CHONG Feng,LI Dong-feng,LI Rui-zhi,WAN Hong.Beijing Neurosurgical Institute,Beijing Tiantan Hospital of Capital Medical University,Beijing 100050,China

Objective To investigate the effects of a chitosan product on scarring and adhesion after never injury in laminectomy in rats. Methods 48 male Sprague-Dawley rats were divided into group A and group B,and carried laminectomy of L4-5,and injured the right spinal nerve roots.The normal saline was smeared on the operation field in the group A,while the chitosan product was smeared in the group B. The adhesion was assessed with Rydell score 1(groups A1/B1),2(groups A2/B2)and 4(groups A3/B3)weeks after operation,while the spinal nerves were observed with HE staining and Masson staining,and the adhesion was assessed with Nussbaum score.The complete blood count and the series of blood chemistries and enzymes for liver and kidney functioning were measured.Results The Rydell scores of adhesion was I grade in group A1,II grade in A2 and III grade in A3,while was 0 grade in B1,0 grade in B2 and II grade in B3.The scar and adhesion contact more loosely in the group B than in the group A,and the Nussbaum score was less in the group B than in the group A at the same time(P＜0.05).The complete blood count and the series of blood chemistries and enzymes for liver and kidney functioning were in normal.Conclusion This chitosan product can prevent the formation of epidural scar and adhesion around the spinal and the nerve roots after laminectomy,with little toxicity and side effects.

chitosan;laminectomy;nerve roots;scar;adhesion;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.012

R651.2

A

1006-9771(2015)01-0045-04

2014-07-24

2014-08-22)

國家自然科學基金項目(No.31440051)。

1.首都醫科大學北京市神經外科研究所損傷修復室，北京市100050；2.北京愛美客生物科技有限公司，北京市100022。作者簡介：蘇迪婭(1987-)，女，漢族，遼寧大連市人，碩士研究生，主要研究方向：周圍神經損傷。通訊作者：萬虹(1963-)，女，漢族，吉林長春市人，博士，主要研究方向：神經系統損傷修復。E-mail:wanhong96@163.com。