載大黃酸的空腔納米球在大鼠體內的血藥濃度測定※

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載大黃酸的空腔納米球在大鼠體內的血藥濃度測定※

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目的 探討高效液相色譜（HPLC）測定載大黃酸的空腔碳酸鈣（CaCO3）納米球血藥濃度，以評價其在大鼠體內緩釋效果。方法 采用HPLC法測定大鼠灌胃載大黃酸CaCO3納米球后不同時點大鼠血藥濃度。結果 大鼠灌胃10 mg/kg的載大黃酸CaCO3納米球后20 min檢測到大黃酸，40 min后達到最大血藥濃度，之后釋放速度減慢，表明大黃酸CaCO3納米球在大鼠體內具有良好的緩釋性能。結論 大黃酸以空腔CaCO3納米球作為載體，在大鼠體內能夠達到良好的緩釋效果。

大黃酸；空腔納米球；緩釋；血藥濃度

大黃酸（Rhein）是大黃游離蒽醌衍生物之一，是從大黃、何首烏、虎杖等多種傳統中藥分離提取出的有效成分。現代研究表明，大黃酸具有廣泛的藥理活性，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、調節腎功能等作用[1-2]。大黃酸能有減少蛋白尿的排泄、抑制細胞外基質的產生以及減輕腎小球硬化等，可明顯改善遺傳性糖尿病小鼠的腎損傷[3-4]。大黃酸還能通過減輕腎臟肥大、改善胰島素敏感性、糾正脂質代謝紊亂及血流變學紊亂等，有效防治2型糖尿病腎病的發生[5]。然而，大黃酸在水中溶解度低、溶出速度慢因而生物利用度低。提高難溶性藥物的溶解度和溶出度，是提升藥物生物利用度的有效途徑之一。

近年來，空腔納米球（hollow nanospheres, HNPs）作為一種新型控釋材料，得到了越來越多的關注。相比于實心的納米粒，這種空腔納米球內部巨大的空腔部分，使載藥的容量有了極大程度的提高，更適合應用于藥物的包載，藥物分子一旦進入空腔，能被屏蔽于體液之外，不至于發生反應和降解。碳酸鈣（CaCO3）是一種應用廣泛的無機化合物。尤其是空腔結構的 CaCO3可以用作藥用載體和診斷標志物，如其他的空腔納米球相同，除了具有優越的生物相容性外，還可生物降解，在體內具有很好的酸度響應性[6-7]。所以利用碳酸鈣制備成空腔納米球，用于載藥，具有比其他無機材料更大的優勢。

本課題組通過利用殼聚糖接枝丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯為模板，制備的空腔CaCO3納米球具有良好的載藥量和體外緩釋效果。本實驗通過將自制的空腔 CaCO3納米球負載大黃酸對大鼠進行灌胃實驗，測定不同時點大鼠血液中的濃度，以評價空腔納米球在大鼠體內的釋放情況。為大黃酸制劑的開發和空腔CaCO3納米球的應用提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 藥品與試劑 空腔CaCO3納米球，本課題組利用殼聚糖接枝丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯模板法自制；大黃酸對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：0757-200206；色譜純甲醇，美國Fisher公司。

1.2 儀器 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D電子天平（賽多利斯）；KDC-16H高速離心機（科大創新公司）；SIB-1型快速混勻器（江蘇醫療儀器廠）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯公司）；RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，由河北省聯合大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK-（京）2006-03-30。雄性，體質量200～240 g。

2 方法與結果

2.1 動物分組與給藥 SD大鼠20只，適應性飼養1周后，隨機分為兩組，實驗前12 h禁食不禁水。一組按大黃酸10 mg/kg的劑量大黃酸CaCO3納米粒灌胃，用1%的羧甲基纖維素鈉制成混懸液灌服，另一組作為空白。將灌好胃的大鼠，腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，于給藥后0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h大鼠眼眶靜脈叢取血0.4 ml于肝素化試管中，離心取上層血漿于 2 ml的離心管中，-20 ℃低溫保存，備用。

2.2 色譜條件選擇 色譜柱：Diomansil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：甲醇-水-冰醋酸（77:22:1）；柱溫：25 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：428 nm[8]。

2.3 大黃酸對照品溶液制備 精密稱取大黃酸對照品3 mg于10 ml容量瓶，用甲醇稀釋至刻度得對照品溶液。

2.4 空白血漿加對照品樣品 處理精密吸取一定體積的對照品溶液，常溫下用氮氣吹干后精密加入0.2 ml空白血漿，振蕩3 min，加入1.75 ml色譜純甲醇，振蕩3 min后離心（離心力1060×g，4 000 r/min，離心5 min），取上清液，50 ℃水浴氮氣吹干，加適量色譜純甲醇在漩渦混合儀中振蕩溶解，通過0.45 μm微孔濾膜過濾即為空白血漿對照品溶液。

2.5 空白血漿及含藥血漿樣品處理 取血漿樣品0.2 ml于的2 ml離心管中，加入1.75 ml色譜純甲醇，振蕩3 min后離心（離心力1060×g，4 000 r/min，離心5 min），取上清液，50 ℃水浴氮氣吹干，加甲醇200 μl，然后在漩渦混合儀上振蕩溶解，再通過0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.6 方法專屬性 為考查血漿樣品中是否存在內源性物質影響測定，分別取大黃酸CaCO3納米球、空白血漿及空白血漿加大黃酸標準品灌喂大鼠后的血漿各20 μl，進樣，同時取一份大黃酸對照品20 μl進樣。結果見圖1。實驗發現，對照品C圖中大黃酸的保留時間為4.279 min。大黃酸加入空白血漿后及灌胃大黃酸納米粒的大鼠血漿色譜圖響應位置上，有相同保留時間的色譜峰（圖 1B、D），且空白血漿樣品無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.7 標準曲線繪制 吸取大鼠空白血漿100 μl，加入精密大黃酸對照品溶液適量，置于離心管內，制得大黃酸濃度分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0 μg/ml的血漿樣本，進樣20 μl分析，以大黃酸對照品峰面積A對大黃酸血藥濃度B進行線性回歸，得線性回歸方程：A=27.934X+1.716（r=0.9993），大黃酸在1.0～15 μg/ml范圍線性關系良好。

2.8 精密度試驗 配制大黃酸對照品高、中、低濃度分別為1.0、6.0、12.0 μg/ml的血漿樣品，每個濃度5份樣品，在1 d內測定樣品，考查本方法的日內精密度。結果測得平均RSD值為5.18%。連續3 d分析樣品，考察方法日間精密度，每天測定1次，連續測定5 d。測得不同濃度的平均RSD值為6.27%。

2.9 回收率試驗 分別取1.0、6.0、12.0 μg/ml大黃酸對照品溶液，用氮吹儀吹干，加色譜純甲醇100 μl溶解，進樣測定，記錄大黃酸峰面積（A），另加入“2.3”項下配制的大黃酸對照品的血漿樣本，每組樣品的高、中、低濃度分別為1.0、6.0、12.0 μg/ml，每個濃度5份樣品，以20 μl進樣分析，分別記錄大黃酸峰面積（S），S值比A值，計算可得大黃酸的平均提取回收率為89.36%。符合藥物動力學研究要求。

2.10 穩定性試驗 按“2.3”項方法，配制低、中、高3種濃度分別為1.0、6.0、12.0 μg/ml大黃酸血漿樣品，在-20 ℃凍存5 d，反復凍融3次，室溫放置6 h。進樣20 μl分析，結果得低、中、高3種濃度的血漿樣品平均RSD為5.19%。表明該樣品符合測定要求。

2.11 對不同時點血漿樣品進行高效液相色譜（HPLC）檢測 將SD大鼠灌胃后取出的不同時間點的血漿樣品，按照血漿樣品的處理方法處理后得到不同時點 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h的樣品，按照上述色譜條件，取20 μl進行進樣分析，根據標準曲線計算出各個時點峰面積所對應的大黃酸濃度（μg/ml）并用時間-血藥濃度來作圖，可得到血藥濃度變化曲線（圖2）。

圖2 血藥濃度的變化曲線

3 討論

本文通過實驗，建立了HPLC測定空腔CaCO3納米球的血藥濃度方法，結果表明，該方法準確靈敏，能滿足生物樣品分析要求，可用于空腔CaCO3納米球的血藥濃度測定。在不同時點對大鼠灌胃后空腔CaCO3納米球的血藥濃度監測中發現，大鼠經灌胃后20 min中后可監測到大黃酸，40 min后釋放速率達到最大值，之后釋放速率減緩。從釋放曲線可看出，大黃酸經由空腔CaCO3納米球負載后，大黃酸隨納米球吸收進入體內，釋放入血的速度明顯減慢，停留在納米球內，不斷由載體中緩慢釋放出來。由于藥物從納米球中的釋放要比藥物從原藥或其他混合劑型向血液中擴散的速度慢，從而提高了藥物的生物利用度[9]。同時證明作為藥物載體時能明顯延長藥物釋放時間，該納米制劑可進入體內循環，為空腔CaCO3納米球在大鼠體內的全面藥代動力學研究提供了實驗依據。

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Carrier Rhein Cavity Nanospheres Serum Concentrations Measured in Rats in Vivo

Niu Huimin Zhang Haoping Qian Zhuang Zhao Jianhua Han Gang Liu Zhanjun

Objective To explore the method of high performance liquid chromatography(HPLC)determination of Rhein loaded cavity calcium carbonate (CaCO3) concentration in blood of nano ball,so as to evaluate the sustained release effect in rats in vivo.Methods Using the HPLC method for the determination of rats administered with carrier rhein CaCO3nanoparticles at different time points after the rat blood drug concentration.Results Rats were gavaged with 10 mg/kg carrier rhein CaCO3nanospheres after 20 min detect rhein,40 min after the maximum blood concentration after release,slow down,show the rhein CaCO3nanospheres with good sustained release performance in rats. Conclusion Retinoic acid on the cavity CaCO3nanoparticles as a carrier,in rats can achieve good effect of extended release.

Rhein;Hollow nanospheres;Sustained release;Blood concentration

R285.5

A

1673-5846(2015)03-0017-03

河北聯合大學藥學院，河北唐山 063000

河北省自然科學基金-石藥集團醫藥聯合研究基金優先資助項目（H2013209192）；河北聯合大學2013年大學生創新性實驗計劃項目（X2013064）

?；勖簦?992-），大學本科。研究方向：藥物新劑型與新技術。E-mail：416097671@qq.com

劉占軍（1967-），大學副教授，碩士生導師。研究方向：藥物新劑型與新技術。E-mail：liuzhanjun815@163.com