基于新型光敏劑的光動力治療在膽管癌中的應用

李 冰，胡賢榮，萬 偉，薄志遠，吳葉晨，鄭 曉，胡 冰

(1.蘇州大學研究生院，江蘇蘇州 215123;2.第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院內鏡科，上海 200438)

膽管癌是起源于膽道上皮細胞的惡性腫瘤［1］，生長部位比較特殊，起病隱匿，當出現明顯臨床癥狀時，腫瘤往往已經進展為中晚期，絕大部分患者失去根治性手術治療的機會，預后極差，死亡率高，癌患者的5年生存率平均是5%～10%［2］。更有研究顯示膽管癌對化療、放療極不敏感［3］，較多臨床研究認為膽管癌根治性手術后患者的5年生存也僅有20% ～40%［4］。膽管癌的這些臨床特點及治療現狀，使其急需一種新的治療方法，近年來隨著醫療技術發展，光動力等微創療法的興起，成為膽管癌治療的研究熱點，而且也取得明顯的成效。

光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)是繼手術、放療和化療之后興起的治療腫瘤的新手段，利用腫瘤組織及細胞對光敏劑(photosensilizter，PS)選擇性吸收，然后在特定波長光照下激發光敏劑，發生光動力化學反應，生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)為主的殺傷腫瘤細胞活性物質，從而達到治療腫瘤的目的。PDT于20世紀70年代用于人類腫瘤的治療，于80年代引入我國，因其對靶組織及損傷程度具有可選擇性，正常組織的損傷微小，有明確的臨床效果，而受到人們的關注，近年來得以迅速興起，并廣泛應用于各類腫瘤的研究和治療。

葉綠光I號(YLG I)是桂林暉昂生化藥業有限責任公司提供的一種新型光敏劑。化學名為2-1-己氧乙基-2-去乙烯基卟吩e6三鈉鹽(HCE6)，屬于葉綠素類二代光敏劑，分子式為C40H47N4O7Na3，分子量為764.79，最大激發波長652 nm，難溶于有機溶劑，易溶于水。分子結構如圖1。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PDT-652 nm AB型光動力激光治療儀由桂林興達有限責任公司提供，葉綠光I號(YLG I)由桂林暉昂生化藥業有限責任公司提供。QBC939系人膽管癌細胞購自上海和元生物技術有限公司。BALB/c裸鼠10只，雌雄各半，四周齡，16～18 g，由第二軍醫大學動物中心提供并飼養，動物許可證號:SCXK(滬)2013-0016。DMEM細胞培養液、胎牛血清，上海和元生物技術有限公司提供。細胞增殖與毒性檢測試劑盒CCK8(批號20140818，Ruian biotech)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 QBC939人膽管癌細胞培養于含10%牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養基的培養瓶中，置于恒溫37℃、5%CO2濃度，飽和濕度的培養箱中。每24 h更換一次培養液，2 d傳代一次。HCE6光敏劑，在實驗當天用無血清DMEM培養液稀釋成實驗濃度。

1.2.2 光毒性與暗度性實驗 CCK8檢測光毒性以及暗毒性條件下HCE6光敏劑對QBC939人膽管癌細胞增殖活性的影響。取4個96孔板，每個96孔板以豎排為一組，每個板分6組，每組5個樣本，取對數生長期膽管癌細胞，將QBC939細胞接種于96孔板中，每孔5 000個，用含牛胎血清的DMEM培養基培養，每孔100μL培養基，當膽管癌細胞貼壁生長后換相應含濃度光敏劑的培養基培養。每板6 組分別換含有不同濃度 0、0.3、0.5、1.0、15、2.0mg·L-1的 HCE6 光敏劑的培養，培養24 h，24 h后棄掉培養基，用生理鹽水沖洗2次，加入無藥培養基，4個96孔板板分別接受光照強度劑量分別為0.6 J ·cm-2(0.1 W，10 min)、1.8 J ·cm-2(0.3 W，10 min)、2.7 J ·cm-2(0.9 W，5 min)，5.4 J ·cm-2(0.9 W，10 min)光強劑量的 PDT 治療，48h后棄掉培養基，生理鹽水沖洗2次，加入10∶1無血清培養基與CCK-8試劑混合液每孔150μL，2 h后在酶標儀上測OD值(450 nm)，測量3次，此過程均為避光。暗毒性實驗時不進行PDT治療，加完光敏劑24 h后，棄掉培養基，用生理鹽水沖洗2次，加入無藥培養基培養48 h后直接測量細胞增殖活性，其步驟與光毒性實驗相同。增殖率數據計算處理后，用GraphPad Prism5繪制增殖率曲線圖。增殖率=(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD×100%。

1.2.3 建立QBC939人膽管癌荷瘤裸鼠模型 培養瓶的細胞總數計數到5×107以上時，培養液稀釋制成1×1010·L-1的細胞懸液5 mL。每只裸鼠于臀部皮下注射濃度為1×1010·L-1的細胞懸液0.15 mL。接種后每2 d觀察動物一次，到觀察到有腫瘤長出后，改為每天觀察一次，并記錄腫瘤長徑(L)、短徑(D)。

1.2.4 光動力治療實驗與病理切片制作 取腫瘤長徑(L)1 cm左右裸鼠，分對照組、實驗組兩組。兩組分別尾靜脈分別注射0、0.5 mg·kg-1光敏劑，24 h后PDT治療，光源距瘤體2 cm，光強度120 J·cm-2，功率0.2 W，治療20 min。光動力治療后每天觀察裸鼠有無角膜光敏感以及腫瘤以外皮膚變化，并分別第1、3、7、10天觀察并記錄瘤塊長短徑，GraphPad Prism5繪制瘤體變化曲線。腫瘤體積計算公式為:V=1/2×L×D2。PDT治療第10天處死裸鼠，取腫瘤置于10%甲醛中固定，浸蠟包埋，制作切片，并HE染色，光鏡下觀察。

1.3 統計方法 采用SPSS 20統計軟件包處理分析數據，所有數據用均數±標準差即(±s)表示。采用方差分析，多個均數間比較采用LSD-t檢驗，顯著性水準為0.05，即P＜0.05差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 光動力處理后QBC939系膽管癌細胞增值率變化以及光敏劑的光毒性與暗度性比較 在QBC939系人膽管癌細胞水平實驗中，特定光照強度下，隨著培養液中光敏劑濃度含量的增加，細胞的存活率逐漸是降低的，但當光敏劑濃度1.5 mg·L-1后，在增加培養基中光敏劑濃度，這個數值不再變化，可能原因是這種膽管癌細胞對光敏劑吸收有飽和現象(圖2)。在a、b兩個光照劑量下無論光敏劑濃度怎樣增加，PDT都無法達到完全抑制，當把光照劑量調到 2.7 J·cm-2(0.9 W，5 min)，光敏劑濃度1.5 mg·L-1時，可完全抑制細胞增殖，這可能是前者光照劑量不夠。當光照強度繼續增加到圖d劑量5.4 J·cm-2(0.9 W，10 min)時，細胞增殖率曲線與c圖無差異，這可能與細胞對光敏劑的吸收量以及光照吸收也有飽和現象有關。可見這類光敏劑在抑制QBC939細胞時存在最適濃度和光照劑量，最適完全抑制濃度為1.5 mg·L-1，最佳光照劑量為2.7 J·cm-2(功率0.9 W，5 min)，超過這些劑量范圍PDT對QBC939細胞的抑制效果不再變化。圖2，a、b、c、d 四組中1.5 mg·L-1與 2.0 mg·L-1濃度組間細胞存活率無統計學差異(P＞0.05)，其余濃度組間均有統計學差異(P＜0.05)。

暗毒性與光毒性在暗度性實驗中，可見到在沒有激光下，對膽管癌細胞抑制作用十分微弱，而有激光治療下，對膽管癌細胞有明顯的有抑制作用。暗毒性下，QBC939膽管癌細胞增殖率下降斜率不明顯，而光毒性下，這個斜率明顯，可見光敏劑的暗度性對癌細胞抑制甚微，而光毒對癌細胞的抑制十分顯著(圖3)。暗毒性曲線，0 mg·L-1與0.3 mg·L-1間細胞增殖率比較無統計學差異(P＞0.05)，1.5 mg·L-1與 2.0 mg·L-1間細胞增殖率比較無統計學差異(P＞0.05)，其余濃度組有明顯統計學差異(P ＜0.05)。光毒性曲線，1.5 mg·L-1與 2.0 mg·L-1間細胞增殖率比較無統計學差異(P＞0.05)，其余濃度組有明顯統計學差異(P＜0.05)。

2.2 裸鼠荷瘤瘤體變化對比 圖4，A圖為光動力10 d后光動力組(下)與對照組(上)裸鼠腫瘤體積比較，B圖為相應裸鼠處死后摘取的瘤塊;兩組裸鼠上面一排為對照組，下面一排為實驗組。實驗組瘤塊體積(0.5 ±0.010)cm3，對照組瘤塊體積(2.25 ±0.015)cm3，實驗組與對照組有明顯統計學差異，P＜0.05。動物模型實驗中，PDT前各組腫瘤大致相似平均(0.073±0.012)cm3，無明顯差異。實驗處理第3天開始，實驗組和對照組有明顯腫瘤體積差異(P＜0.05)，到第10天，實驗組與對照組體積差異明顯，實驗組瘤塊體積(0.5 ±0.010)cm3，而對照組為(2.25±0.015)cm3。實驗組和對照組除光照處外，均無皮膚變色壞死，也無角膜光敏感。

圖5，光動力治療后，不同時間(1、3、7、10 d)，實驗組與對照組瘤體變化曲線。PDT后不同時間點，對照組瘤體平均體積明顯大于實驗組，對照組生長曲線斜率明顯高于實驗組。可見對照組瘤體生長速度明顯高于實驗組。實驗組與對照組在PDT后同一天，以及各組間PDT后不同時間段瘤塊體積大小，均有顯著統計學差異，P＜0.05。

2.3 實驗組與對照組瘤體病理對比 圖6，A(100倍)、B(400倍)為對照組瘤塊病理切片HE染色光鏡下視圖。C(100倍)、D(400倍)為實驗組瘤塊病理切片HE染色光鏡下視圖。對照組(A、B)瘤組織可見瘤組織中央部位無壞死區域，邊緣瘤細胞增殖旺盛，瘤組織外有包膜，腫瘤細胞大而且細胞核深染，核漿比例大，細胞核異型性非常顯著，可觀察到核分裂。實驗組(C、D)瘤組織內部見大片的變性、壞死區域，腫瘤邊緣可見殘存腫瘤細胞，腫瘤組織內可見出血，腫瘤細胞核可見固縮、碎裂及溶解，細胞可呈崩解狀態。

3 討論及結論

PDT對腫瘤組織及細胞的殺傷機制主要有三方面［5］:(1)誘導組織細胞凋亡與壞死。Cao 等［6］在QBC939系膽管癌細胞水平和荷瘤裸鼠模型實驗中，發現經光動力治療后腫瘤與對照組相比細胞凋亡率明顯增高，細胞內細胞色素C、caspase-9和caspase-3表達明顯增高，證明了光動力可誘導QBC939系膽管癌細胞細胞色素 C、caspase-9和caspase-3的釋放，并激活誘導QBC939細胞的的壞死和凋亡。(2)對腫瘤微血管損傷。PDT能導致炎性反應和炎性因子的釋放，引起血管收縮、血流停滯，致使腫瘤組織水腫、缺血、壞死，從而達到殺傷腫瘤的目的［7］。(3)誘發免疫及炎癥。PDT可引起組織內免疫炎癥相關因子TNF、IL22等細胞因子表達。PDT的免疫作用涉及腫瘤細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及細胞因子等方面［8］。

自20世紀80年代從HpD(血卟啉衍生物)中分離純化出 PhotofrinⅡ(光敏素Ⅱ)［9］，為目前臨床上常用的一代光敏劑，對應的激發波長630 nm。這類光敏劑在膽管癌的基礎研究國內外都有很多，無論細胞水平還是活體動物方面成效都很顯著。一代光敏機在臨床實驗也相當成熟，但在國內應用沒有國外多，而且在膽管癌臨床治療中還不夠理想。一些臨床應用顯示這類光敏劑有兩個重要局限，皮膚光敏感長(3個月)和殺傷腫瘤深度有限(4～6 mm)［10］，而臨床研究顯示膽管癌大多侵犯深度為7～9 mm［11］，可見殺傷深度是其重大弊端。二代光敏劑最早出現于20世紀80年代，近年來新發光敏劑頻出不斷。與一代光敏劑相比，成分單一、分子結構明確、最大紅外吸收波長更長，吸收系數高，ROS產率高，對腫瘤的殺傷效果更強，副作用小，這類光敏機在國外研究和應用都比較頻繁，但在國內還尚未有用于臨床治療的報道。常用于膽管癌研究和治療的有ALA、mTHPC、HYP等，這些光敏劑與一代光敏劑比較，在人體內的殘留時間明顯降低，對皮膚的光毒性也明顯減小。Kniebühler等［12］用 mTHPC 光動力(0.032 ～0.063 mg·kg-1，652 nm，50 J ·cm-2)聯合ERCP支架植入治療13個無法手術患者，光動力治療后患者平均生存期可達13個月，并用熒光動力學測量空腔黏膜光敏劑最大濃度時間是注射光敏劑后3.85 d，但皮膚光敏感時間長是其主要缺點。三代光敏劑是于二代光敏劑基礎上結合某些生物或者化學成分，如抗體、氨基酸、糖、脂類、蛋白質等，以增強光敏劑對腫瘤組織的選擇性或生物相容性［13］，但這類光敏劑仍處于實驗室研究中，國內外未見臨床應用報道。其中有在膽管癌細胞水平的一項研究，Lee等［14］用殼聚糖和熊去氧膽酸制作的納米材料，與光敏劑Ce6(二氫卟吩E6)形成離子結合物，用于HuCC-T1系膽管癌細胞光動力治療研究，他的結果表明納米材料能增強膽管癌細胞對光敏劑的吸收以及膽管癌細胞內ROS產生量。

HPPH為二代光敏劑，在665 nm處有很強的吸收峰，這些特性使其比卟吩母鈉(630 nm)和m-THPH(652 nm)有更強的組織穿透性［15］。已用于肺癌、食管癌、頭面頸癌、膀胱癌、胃癌等多種實體腫瘤的治療，但未見在膽管癌中的研究及應用。葉綠光I號(YLGI)是HPPH衍生物，其增加水溶性，卻降低了脂溶性，更容易在活體內代謝。YLGI是葉綠素類二代光敏劑，分子式為C40H47N4O7Na3，分子量為 764.79，最大激發波長 652 nm，難溶于有機溶劑，易溶于水，易于在人體內代謝，所以最大優點就是代謝快，皮膚光敏感時間短，副作用微小。但由于其脂溶性降低，可能會降低其在細胞內的積累，以及光毒性。無論細胞水平還是裸鼠荷瘤動物實驗，YLG I-PDT對膽管癌生長抑制效果十分明顯，而且暗度性微弱，也未見到皮膚光敏感。本實驗已在細胞水平和活體動物實驗上看到了其明顯的抑制腫瘤效果和相對安全性，但其在臨床上效果仍需要大量基礎和臨床實驗去驗證。

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