自噬參與缺血性心臟病的發生發展

馬夢晴，林先和

(安徽醫科大學第一附屬醫院心血管內科，安徽合肥 230022)

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)即冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)，又稱冠心病(CHD)，是一種常見的心臟病。IHD主要由于長期心肌缺血導致心肌細胞供氧需氧失衡、能量代謝障礙、局限性或彌漫性纖維化，后期不可避免的會引起心功能障礙、心室擴張、心肌纖維化及重塑等一系列臨床表現綜合征。這主要是由于缺血后大量的心肌細胞丟失導致心臟收縮力進行性下降所致，最終不可避免的進入心力衰竭階段，成為全世界患者死亡的一個主要因素［1］。對于缺血心肌，快速的血液再灌注成為治療的關鍵，然而，盡管再灌注的有效性，再灌注之后的損傷仍舊嚴重威脅著心肌的存活。因此，明確理解心肌缺血發病的分子學機制并探索有效的治療措施顯得尤其重要和迫切。證據表明自噬參與許多心臟疾病的發病機制，基礎水平的自噬可維持細胞的正常生理平衡，而病理狀態下可作為一種應激的適應性反應而明顯升高［2］，因此自噬被廣泛的認為是一個潛在的治療缺血性心臟病的靶點。

1 自噬

真核細胞系統主要包括泛素和自噬/溶酶體兩個蛋白質降解系統。前者可選擇性的通過降解短壽命蛋白來維持基本的細胞生命代謝，而后者則是應激時細胞維持內環境穩定的重要機制，它通過溶酶體降解胞內異常大分子蛋白以及損傷的細胞器，進而實現物質和能量的更新。自噬以胞質內出現自噬體為特征，早在20世紀50年代初，比利時科學家Christiande Duv便首次觀察到了自噬體，并隨后提出了自噬(autophagy)的概念［3］。

1.1 自噬的分類 自噬有多種分類方法，依據底物轉運方式不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)，其中巨自噬是最活躍和典型的自噬形式，也就是通常所說的自噬。微自噬中，溶酶體外膜通過突出、內陷、分隔方式直接攝取底物入溶酶體腔進行降解。CMA是一種僅存于哺乳動物且具有選擇性的自噬類型，胞質中可溶性底物蛋白(常含有特異性KFERQ五肽模序)可被熱休克蛋白70(heat shock protein of 70 kD，HSP70)特異識別，進而在溶酶體相關膜蛋白2α(1ysosome-associated membrane protein type-2α，LAMP2α)的協助下轉位至溶酶體腔內進行降解。巨自噬和微自噬均無特異性，CMA具有特異性，但只能降解特定蛋白質而不能降解受損的細胞器。按能否與降解底物特異性結合，自噬也可以分為選擇性自噬和非選擇性自噬，前者需要特異性受體的參與［4］，其中P62是哺乳動物中目前研究較為清楚的自噬特異性受體［5］。選擇性自噬根據細胞器的不同又可以分為線粒體自噬(Mitophagy)［6］、內質網自噬(Reticulophagy)［7］、核糖體自噬(Ribophagy)以及伴侶蛋白調節的自噬(Chaperonemediated autophagy)等。

1.2 自噬的相關基因(ATGs)及其調控過程 酵母是研究自噬的經典對象，其內發現了多種參與調控自噬的自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)，編碼的分子也已被鑒定并統一命名為Atg。自噬進化上高度保守，從酵母到哺乳動物依賴于相似的核心系統，在哺乳動物體內大多數ATGs可找到相應的同源基因［8］。自噬途徑的分子組成主要涉及到Atg1激酶復合物、mAtg9信號通路、磷脂酰肌醇3-羥激酶(PI3K)/Vps34復合體及兩種泛素樣蛋白共軛系統四個亞組，每個亞組都包含了多種ATG分子，在不同階段不同部位對自噬調控發揮不同作用。

自噬過程可分為誘導膜體啟動、囊泡轉換及物質降解3個過程［9］。自噬誘導信號激活后，胞質內首先形成一來源于非溶酶體膜的雙層膜結構，并不斷向兩邊延伸成扁平狀，也稱為隔離膜或自噬前體。隔離膜逐漸包裹胞漿內的降解底物，形成密閉的囊泡結構，稱為自噬體。隨后，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬體內膜和底物被溶酶體酶降解，產物被重復利用。自噬激活的每一過程中均涉及多種分子信號調控。自噬可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein，m-TOR)依賴性途徑以及非m-TOR依賴性途徑激活［10］，目前已知的自噬激活最經典的信號通路是以m-TOR為中心的信號系統。

m-TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的敏感感受器，為調控細胞生長與增殖的一個關鍵通路，可負性調控自噬［11］。自噬啟動后，m-TOR可通過 RTKClassI PI3K-PIP3-PDK-1-Akt途徑激活而抑制自噬［12］，同時，活化的RTK還可通過激活Ras-MAPKERK1/2信號通路促進自噬前體的形成而誘導自噬［13］。此外，作為能量代謝感受器的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)不僅可以通過直接磷酸化P27誘導自噬發生，也可以通過磷酸化TSCl/2復合體抑制m-TOR激酶活性，進而激活自噬。

m-TOR激活可磷酸化核體蛋白S6(p70S6)，促進mRNA翻譯，促使核糖體與內質網黏附，抑制自噬體膜的形成，阻礙自噬激活［14］。營養豐富狀態下，m-TOR通過絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化Atg13，Atg1-Atg7激酶復合物進而與磷酸化的Atg13解離，Atgl激酶活性降低，抑制自噬的發生。相反，營養缺乏狀態可通過抑制m-TOR的活性，促使Atg13去磷酸化并重新結合到 Atg1-Atg7激酶復合物，激活Atg1激酶，啟動自噬的發生［15］。另一方面，Ⅲ類磷酸酰肌醇3激酶(ClassⅢ PI3K)激活后，與Beclin1(與酵母Atg6同源)及Vps34結合成的Beclin1復合物也可誘導自噬的發生。Beclin1由BH3結構域、CCD結構域以及進化保守的ECD結構域組成，Vps34與CCD及ECD相結合，營養充足的情況下，BH3結構域通過與BcL-2家族相結合而維持穩定狀態，營養缺乏時，BcL-2與Beclinl分離，Beclin復合物激活釋放而誘導自噬形成隔離膜［16］。

自噬啟動后可引起一系列自噬相關分子連鎖反應，該過程主要涉及到Atg5-Atg12-Atg16和LC3Ⅱ-PE兩個泛素蛋白連接系統。首先，泛素活化酶Atg7和Atg10通過C端甘氨酸殘基活化Atg12，并使其共價結合到泛素轉移酶Atg5形成Atgl2-Atg5復合物。自噬發生時，同源二聚體Atg16-Atg16與一對 Atg12-Atg5非共價結合，形成 Atg12-Atg5-Atg16復合物并定位于隔離膜上［17］。另一方面，微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light-chain 3，LC3)在半胱氨酸蛋白酶(Atg4)作用下，分解暴露出C端甘氨酸殘基，形成LC3-Ⅰ，之后被Atg7和Atg3(LC3特異性E2樣蛋白)激活，在上游Atg16-Atg12-Atg5復合物的誘導下連接到1分子磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)形成LC3-Ⅱ，并定位到隔離膜上，隨后誘導雙層膜延伸并包繞胞內降解底物，最終形成雙層膜結構的自噬體。自噬體形成后，Atg12-Atg5-Atg16復合物從隔離膜上脫落，而LC3-Ⅱ則停留在膜上，直至和溶酶體融合后才脫落，故許多研究中用LC3來檢測自噬水平的高低，原因就在于此。其中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值測定更具代表性，因為它是一種自噬流水平的檢測［18］，而非單純的以自噬體有無或者數量多寡評價自噬，這可使自噬的檢測更科學全面一些。

1.3 自噬的病理生理學效應 作為細胞維持內穩態平衡的管家機制，自噬廣泛存在于真核生物生命活動中。自噬能調控過氧化物體、長壽蛋白以及細胞器的降解及更新，同時也作為一種防御機制抵御環境變化對細胞造成的損傷。當細胞遭受外源性刺激如氧化應激、營養缺乏、感染以及低氧等，自噬降解產物可為細胞的重建、再生和修復提供能量供給以及必需原料，維持細胞結構及功能的平衡［19］。過度的自噬可誘導不依賴于caspase酶的Ⅱ型程序性細胞死，自噬不足時，則可打破細胞原有的平衡，導致人體各個系統疾病的發生［20］。

自噬的異常可導致帕金森(Parkinson disease，PD)、阿爾茨海默病(Alzhecimer’s disease，AD)及亨廷頓病(Hunting’s disease，HD)等中樞神經系統疾病:激活線粒體自噬信號的異常是PD發生的原因［21］，AD 是由于自噬異常導致 β-淀粉樣蛋白(Aβ)的過多沉積所致，HD的病理改變也與自噬水平異常所導致的huntingtin蛋白聚集有關［22］。研究表明，自噬異常也可導致錯誤蛋白聚集在肝臟而致瑞士綜合征(Reye’s Syndrome)中［23］，而鼠模型中用藥物激活自噬則顯現出了對肝臟的保護作用［24］。此外，自噬還涉及在諸多腫瘤相關性疾病及衰老［19］的病理生理機制中。

2 自噬和心臟疾病

心肌細胞是一種無再生能力的高分化終末細胞。應激時，心肌細胞可通過自噬過程對物質及能量進行更新，以維持心臟功能和細胞存活。心肌富含線粒體，不良刺激容易導致線粒體受損同時釋放細胞色素C等促凋亡因子，而自噬能降解、回收并選擇性移除受損線粒體，抑制凋亡發生。越來越多的證據表明自噬的異常可促進許多心血管疾病的發生與發展。自1976年心肌細胞自噬被報道以來，自噬與心血管疾病的關系日益為研究者們所重視并成為研究的熱點。目前，由于自噬的研究沒有達成統一的規范化標準，國內外不同層次水平的眾多研究中，自噬所起作用并不完全相同，甚至出現完全相悖的結論。

2.1 心肌缺血再灌注損傷(I/R)和自噬 心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷的病理生理過程涉及到自噬的參與，但其具體分子機制仍舊不明，大家對在心臟I/R過程中自噬所起正性或負性作用仍舊沒有統一觀點，這可能與不同階段的自噬活動可由不同的信號分子調控有關。研究認為自噬在缺血早期發揮的保護作用可能通過AMPK介導，而再灌注過程中則可能通過Beclin1發揮損傷作用。心臟缺血階段，低氧、ATP減少及損傷細胞器均能激活自噬，自噬產生的降解產物如脂肪酸、氨基酸等被用來產生能量，成為心肌細胞缺氧耐受的重要調節機制。通過手術造成心肌缺血的小鼠模型中，于缺血30 min后即可檢測到大量的自噬小體。研究也表明，I/R后盡管能量危機緩解，但其他促自噬機制如氧化應激、線粒體損傷、內質網應激及炎癥反應卻可進一步激活自噬。經過40 min缺血和再灌注的家兔心臟模型中也觀察到了自噬活動的明顯增強。隨后，諸多不同動物模型實驗也證明了心肌缺血后自噬活動增強，而再灌注時自噬進一步加強［25-26］。

研究表明自噬激活在心臟I/R中是具有心肌細胞保護作用的。哺乳動物mTOR抑制劑雷帕霉素預處理能減輕I/R損傷，提示了mTOR途徑介導的自噬保護作用［11］。離體實驗的I/R模型中，過度表達Atg5、Beclin1或給予雷帕霉素預處理上調自噬，HL-1或離體培養的大鼠心肌細胞死亡減少，損傷耐力也增強，而當給予RNAi或3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine，3-MA)抑制自噬時，細胞凋亡和壞死均明顯增多。此外，豬心肌反復頓抑后自噬增加、凋亡減少的實驗也提示自噬了具有抑制凋亡的作用，同時如果抑制缺血預處理所誘導的自噬，則缺血預處理對心臟的保護作用就會消除［27］。心肌細胞無再生能力，而心臟又是高耗能的器官，故在缺血再灌注過程中能否維持能量平衡直接決定這細胞的存亡。自噬的保護作用在于它能清除I/R過程中產生的釋放促凋亡因子的受損線粒體的堆積以及內質網等有害物質，進而抑制凋亡的發生并促進物質的更新。另一方面，蛋白酶降解系統在I/R過程受到抑制、功能不全時，白噬可以與其協助互補降解毒性蛋白產物，從而減輕IR損傷口［28］。

然而，當自噬對細胞內容物的消化超過一定限度時，自噬在I/R過程中也表現出促心肌損傷作用。大鼠H9c2心肌饑餓細胞模型中當阻斷Beclin1或者藥物抑制自噬時可減少細胞凋亡，Beclin1敲除的小鼠模型由于自噬水平的下降，其再灌注時的凋亡水平和心梗面積也有了明顯的減少。所有這些研究結果顯示，心肌缺血階段雖然可通過AMPK途徑激活的自噬對心臟進行保護，但再灌注階段通過Beclin1途徑激活的自噬對心臟卻表現出損傷性的作用。我們都知道物極必反的道理，生物體內任何反應過程都是動態變化而非絕對的，自噬也是一樣。心肌缺血階段，自噬可以通過降解損傷性的物質進行代償，但當再灌注導致的應激性損傷物質如自由基等進一步增多，并遠遠超過自噬生理水平，或者自噬的激活趕不上損傷物質增加的速率時，自噬便不能繼續發揮原來的保護機制。再灌注階段，自噬的過度激活往往伴隨著溶酶體酶的明顯增加，這可導致正常蛋白質及細胞器的降解，從而誘導不可逆性的細胞死亡。其次，BcL-2和Beclin1之間的平衡也往往決定著這自噬對細胞存亡的作用。BcL-2可負性調節 Beclin1的促自噬作用，再灌注時BNIP3的增加以及BcL-2的下降都會加劇Beclin1誘導自噬的激活，但升高的BNIP3本身就具有增加超氧化物、促進凋亡因子產生及破壞線粒體完整性的作用，而BcL-2是一種抗凋亡蛋白。最后，自噬和凋亡也存在著某些共同的作用通道。例如參與自噬過程的Atg5本身就能直接與凋亡相關蛋白相互作用而誘導自噬性的細胞死亡。此外，也有報道認為誘導自噬增強的Beclinl的BH3結構域也具有直接激活凋亡的能力，故當其促凋亡能力超越所激活自噬的保護作用時，就可表現為I/R的損傷作用。

2.2 心肌肥厚和自噬 心肌肥厚指心肌纖維的增粗，往往發生在超負荷條件下，也是缺血性心臟病發展到一定程度出現的病理改變。當心臟需求量增加時，無再生能力的心肌細胞首先發生代償性的向心性肥大來增加心輸出量。壓力持續性存在時，則表現為心功能失代償的離心性肥大，導致心肌細胞變長，室壁變薄，心室病理性重塑，最終演變為進行性加重的心衰、心律失常、栓塞甚至猝死，預后差，死亡率高，目前尚無特異性治療方法。

多研究表明，自噬參與心肌細胞大小及整體心臟結構和功能的代償性調節。敲除Atg5基因的動物模型早期雖無異常表現，但增加后負荷后，則出現了左心室的擴張以及心功能障礙，成年后則導致了快速的心臟肥厚、心室擴張及收縮功能異常，RNAi抑制Atg7也可誘導新生大鼠心肌細胞肥大。雷帕霉素可通過激活自噬對壓力超負荷下形成的心肌肥大有明顯的改善作用。然而，亦有報道認為自噬參與促進了心肌肥大的發生與發展，心臟特異性表達mTOR的轉基因小鼠模型中，和對照組相比，橫斷型主動脈縮窄(TAC)后出現的心肌肥大、纖維化以及炎癥反應均減輕［29］。

疾病的損傷程度及自噬水平的不同可能導致了自噬在心肌肥大中不同甚至相反的作用。心肌肥大的早期可通過AKT1-mTOR介導的自噬抑制發揮調節作用，而后期心肌細胞持續性的肥大可造成血供不足，繼而誘導自噬的增強。既往TAC模型實驗發現，Beclin1誘導自噬增強的小鼠心功能及病理性重塑均較對照組減少，但當自噬進一步加強后，模型組的心功能及心肌病理性重塑均較對照組惡化。這些研究表明，壓力超負荷初期，自噬可通過提高心肌細胞抗壓能力而起到保護作用，但當負荷過重時，進一步的自噬卻可以促進疾病的進展，從而導致病理性的心肌重塑。

2.3 心肌纖維化與自噬 心肌纖維化指心臟中成纖維細胞增生并向肌成纖維細胞轉化，而后者產生的膠原2倍于前者，膠原降解也減少，最終可導致膠原纖維過量沉積在胞外基質并伴有各型膠原的比率失調和排列紊亂。心肌纖維化涉及在各種各樣心臟疾病的病理變化過程中，包括缺血性心肌病、心律失常、慢性心衰及冠狀動脈粥樣硬化性心臟等。而自噬作為細胞應激狀態下的一種內穩態平衡機制，也可能涉及在心肌纖維化的發病機制中。研究表明，糖尿病小鼠動物模型中，自噬可通過氧化應激激活并抑制了心肌細胞間質增生及纖維化浸潤。然而，也有實驗發現在通過粒細胞刺激因子減少細胞自噬水平的地鼠模型中，其心肌間質的纖維化輕于對照組，心臟收縮功能也高于對照組［30］。目前，心肌細胞纖維化的發生與自噬之間的機制尚未完全闡明，自噬在心肌纖維化的發病機制中到底起抑制作用還是促進作用，以及其與心臟纖維化的發生發展有無時間相關性，還需進一步的動物模型及臨床試驗研究。

2.4 心力衰竭和自噬 心力衰竭(heart failrue，HF)為各種心臟病發展的終末期階段。盡管內科藥物治療(包括ACEI、β受體阻滯劑、利尿劑)及外科心臟再同步化治療、植入型體內自動除顫器等器械治療可一定程度上改善心衰癥狀，但其死亡率仍舊很高。因此，詳細闡述心衰發病機制并研發新的治療方法顯得尤為重要。近年來越來越多的研究表明自噬參與HF的發生發展過程，自噬存在于人類心臟病中的證據最初就是來源于27例終末期心衰移植的心臟超微結構分析［31］。應激早期，自噬的上調可以有效清除受損線粒體，消除過多的活性氧產物，起到心臟保護作用，而抑制自噬則促進了心肌細胞死亡［32］。當心臟處于缺氧缺血，超壓力負荷等持續應激狀態時，為適應環境，心肌細胞便發生重塑，進而影響心功能。盡管很多證據顯示自噬源性的細胞死亡也可能是導致心衰的病因，高壓力負荷誘導的自噬可加重心肌功能不全并參與心衰的發生，但關于自噬上調和HF的因果關系仍尚未明確。

3 結論及展望

自噬普遍存在于細胞的正常生理及病理過程中，它能通過清除細胞內過量或受損的細胞器和蛋白質來維持內穩態平衡，但自噬的不足及過度又可導致相關的疾病。缺血性心臟病無論是在發病的缺血階段還是后期導致的心肌肥厚、心肌纖維化以及心衰的病理改變上，甚至在再灌注治療后的療效上均涉及到細胞自噬的復雜調控。隨著研究不斷的深入，自噬在缺血性心臟病中的作用日益成為學者們關注的焦點，其在疾病發生發展中的分子學機制及具體作用也正被逐步揭示，目前自噬在心血管領域被研究的熱點主要集中在內質網應激、線粒體自噬以及泛素—蛋白酶體系統等方面。

自噬水平的靶向治療可能對許多疾病都發揮積極的作用。目前，臨床已經開展了靶向自噬用于相關疾病特別是血管性疾病的治療［33］。針對缺血性心臟病，臨床上則主要是從自噬信號途徑比如mTOR、PI3K/AKT、P27等信號通路上加以干涉，通過基因修飾技術對自噬途徑中的關鍵信號分子在冠心病進展不同階段進行有效調節，以此達到治療心血管疾病的目的。近年來，雖然在自噬分子水平機制上的研究，包括自噬的起源、信號的調控等已取得重大進展，但關于自噬對缺血性心臟的保護性和致病性仍需進一步深入探討，相信隨著人們對生物化學、遺傳學以及信號轉導等研究的不斷深入，靶向自噬用于缺血性心臟病的干預以及相關自噬抑制劑的使用將為心血管疾病的治療開辟一新的領域。

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