烏頭提取物對心衰大鼠抗氧化能力的研究

劉 穎，譚波宇

(湖南省人民醫院藥學部，湖南長沙 410005)

心力衰竭(HF)是一種由于心肌受損、心臟的持久過負壓引發的疾病，嚴重時導致心臟失代償，血液不能運達供給全身，以心功能不全為主要表現。本病歸屬于中醫學“心悸”、“喘證”、“水腫”、“痰飲”等范疇［1］。超氧化物歧化酶(SOD)是人體內的一種抗氧化酶，它的主要作用在于其特異性能夠清除超氧陰離子，同時催化超氧化自由基(ROS)分解，并在過氧化酶的作用下發生氧化反應［2］。丙二醛(MDA)是過氧化脂質的分解產物，它可引起蛋白質變性，酶及激素失活等。研究發現心衰時，機體內氧化能力降低，SOD、MDA與還原型谷胱甘肽(GSH)的水平則呈現一個較低的狀態，進行抗心衰治療后，機體抗氧化能力有所恢復，SOD、MDA 與 GSH 的水平也有所上升［3-5］。烏頭作為祖國醫學中的溫補藥物，在記載中對于心衰的治療往往具有較好的療效，筆者通過觀察在烏頭提取物作用下Wistar大鼠體內SOD、MDA、GSH指標，來探究烏頭提取物對心力衰竭的治療效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物實驗 選取心衰Wistar大鼠90只，由中山醫科大學動物中心提供(動物合格證號SCXK 2004-0011)，采用隨機數字表分為實驗組、對照組及空白組，每組30只，依據遵循中國科學技術委員會制定的《實驗動物管理條例》進行實驗操作。各組實驗動物的體重、飼養方式差異無顯著性。

1.2 主要試劑及儀器 烏頭(湖南省人民醫院藥劑科);SOD分析試劑盒(南京建成生物工程研究所);MDA分析試劑盒(南京建成生物工程研究所);GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所);立式壓力蒸汽滅菌器(西安中諾爾儀器有限公司)、電子天平(賽多利斯分析天平)、低溫高速離心機(湖南湘儀離心機有限公司)、旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器)、旋渦混勻器(合肥艾本森科學儀器有限公司)、流式細胞分析儀、分光光度計(上海圣科儀器設備有限公司)以及共聚焦顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)等。

1.3 制備烏頭提取物 取干燥的烏頭根300 g粉碎，過30目篩。以乙醇為溶劑，索氏提取器回流提取，過濾并用旋轉蒸發儀回收溶劑得乙醇提取物浸膏。加入少量水使混懸，而后依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇依次萃取，用旋轉蒸發儀回收溶劑，最終制取3 g·mL-1藥物濃度的烏頭提取物。

1.4 制備模型 實驗組與對照組采用腹主動脈縮窄法制作慢性心衰大鼠模型［6］。大鼠用1%戊巴比妥鈉溶液0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉后，綁于鼠臺上，用碘酒擦拭待剪開的皮膚，在劍突下腹正中開2～3 cm口，分層打開腹腔，將臟器擠壓在大鼠的右側以便找尋腹主動脈，在腎動脈分支以上鈍性游離腹主動脈，穿過4號手術線并系一活扣，將7號注射器針頭平行置于腹主動脈上，用4號手術絲線將腹主動脈和注射器一同結扎，松緊適中，然后緩慢將注射器撤出，給青霉素1支(8萬單位)，關腹，分層縫合。

1.5 治療方法 造模成功后，實驗組與對照組以地高辛20 mg·kg-1尾靜脈注射，每日一次，連續干預28 d，空白組以等體積生理鹽水尾靜脈注射0.04 g·kg-1，共28 d。實驗組給予上述烏頭提取物溶液灌胃0.04 mg·kg-1，共28 d。成功建模后選取第0天，第7天和第28天，每組分別選取10只動物，采取腹腔注射麻醉后，腹主動脈并取血，檢測SOD、MDA與GSH水平。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 觀察檢測SOD、GSH活性 應用黃嘌呤氧化酶法:血液離心(3 500 r·min-1)處理10 min，留取上清液檢測SOD、GSH活性。測定管及對照管分別加入試劑或樣品，充分混勻后放置在37℃水浴箱中作用40 min，加入顯色劑后混勻，靜置10 min倒入光徑比色杯中，在波長550 nm處用蒸餾水調零，比色測定各樣本A值，依據按公式計算SOD活性。

1.6.2 檢測MDA含量 檢測MDA含量應用TBA比色法:離心(3 500 r·min-1)處理心肌組織10 min，取上清液待測。標準管、標準空白管以及測定管中分別加入烏頭提取物，旋渦混勻器混勻后，用保鮮膜扎緊試管口，刺一小孔，放置在水浴箱中(95℃)作用40 min后取出，流水冷卻，離心(3 500 r·min-1)處理10 min，取上清液置入光徑比色杯，在波長532 nm處采取蒸餾水調零處理，比色測定A值，按公式計算MDA含量。

1.7 統計學方法 采用統計學軟件SPSS19.0進行統計學分析，三組計量資料采用單因素方差分析的方法，三組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各組SOD活性比較 對照組與實驗組的心衰大鼠體內SOD值明顯低于空白組，實驗組的變化小于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 治療前后心衰大鼠體內SOD活性比較情況(±s)

表1 治療前后心衰大鼠體內SOD活性比較情況(±s)

注:與空白組比較，#P ＜0.05，與實驗組相比，*P ＜0.05。

組別氧化物歧化酶SOD/U·mL-1 0 d 7 d 28 d實驗組 126.9 ±26.3# 168.4 ±16.5# 193.5 ±12.5#對照組 131.4 ±18.5# 864.3 ±25.4#* 839.1 ±28.6#*空白組215.2 ±13.3 213.8 ±11.6 202.7 ±10.4

2.2 各組MDA含量比較 對照組與實驗組的心衰大鼠體內MDA值明顯高于空白組，實驗組的變化小于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 治療前后心衰大鼠體內MDA含量比較情況(±s)

表2 治療前后心衰大鼠體內MDA含量比較情況(±s)

注:治療后，與空白組比較，#P＜0.05，與實驗組相比，*P＜0.05。

組別丙二醛MDA/mmol·L-1 0 d 7 d 28 d實驗組 3.69 ±0.75 14.43 ±8.32# 26.48 ±4.64#對照組 4.01 ±1.35 10.25 ±5.62#* 17.67 ±4.36#*空白組6.69 ±0.75 6.78 ±0.65 6.85 ±0.38

2.3 各組GSH含量比較 對照組與實驗組的心衰大鼠體內MDA值明顯高于空白組，實驗組的變化小于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 治療前后心衰大鼠體內GSH含量比較情況(±s)

表3 治療前后心衰大鼠體內GSH含量比較情況(±s)

注:治療后，與空白組比較，#P＜0.05，與實驗組相比，*P＜0.05。

組別還原性谷胱甘肽GSH/μmol·L-1 0 d 7 d 28 d實驗組 16.43 ±6.54 26.23 ±5.64# 40.24 ±7.26#對照組 15.25 ±1.35 22.87 ±7.28#* 28.46 ±5.46#*空白組41.12 ±5.78 42.10 ±6.25 44.86 ±7.81

3 討論

心力衰竭是世界范圍內引發嚴重病癥甚至死亡的疾病之一，各種心臟病發展到嚴重階段都會引發心衰，心臟失代償導致供血不足，是一種高發病率的臨床病癥狀群。是指在致病性因素的作用下，心收縮功能與舒張功能所發生的障礙，心泵血功能發生降低，使得心輸出量出現下降，以至于無法滿足機體正常的代謝需要進而出現的一種病理過程。在疾病發生發展的早期，交感神經系統和腎素—血管緊張素—酸固酮系統被激活，心肌出現增生和肥厚，這在一定程度上是發揮了代償性作用，但是這一類的代償性機制卻會導致心功能的進一步損傷，其最終結果是加速了疾病的發生發展。當心衰發生時，可以通過監測SOD、MDA與GSH這些指標來觀察心肌抗氧化能力并由此來監測疾病發展［7-10］。SOD是細胞內所含有的一種抗氧化酶，它通過清除超氧陰離子，減弱氧自由基對細胞的損傷，從而起到保護機體的作用，SOD含量的多少能夠間接的反映機體對氧自由基的清除能力。本實驗通過測定SOD來觀察烏頭提取物是否能對抗自由基的損傷［11-13］。MDA是指在氧自由基的攻擊下，生物膜中的不飽和脂肪酸發生了脂質過氧化性反應，其最終產物即為MDA，因為其較強的細胞毒作用可造成細胞的損傷和組織功能的損傷，又因其能夠促進氧自由基的產生，細胞毒作用會得到進一步的擴大。含量的多少亦可間接反映體內細胞所承受的自由基損傷強度。本實驗結果提示烏頭提取物可能通過調節MDA含量來發揮心血管保護及抗心衰作用［14-16］。GSH則是一類通過催化過氧化物反應，減少氧自由基的生成，從而能夠保持細胞完整的結構及功能。本實驗結果亦可提示，烏頭提取物組GSH水平升高，其可能的途徑是通過抑制氧自由基途徑從而來發揮對心肌的保護作用［17-18］。GSH是細胞內重要的抗氧化物質，因此若抗氧化能力增強，則由心衰引起的心功能不全等一系列病癥將減輕。在以往的心衰治療中主要以利尿劑，血管擴張劑等以軟血管為主的藥劑進行治療，雖效果明顯但副作用大，預后不好易復發。根據文獻記載烏頭堿是川烏、草烏等中藥的主要有毒成分，可以刺激迷走神經，使心率失常，當心衰發生時，在烏頭堿的毒性刺激下可以加強脂質過氧化反應，MDA含量增加，SOD活力降低，GSH升高，抗氧化能力加強［19］。

本次試驗中，造模成功后大鼠血清SOD、GSH與MDA水平明顯低于空白組，提示心衰大鼠體內抗氧化能力減低;干預28 d后，大鼠血清SOD、GSH與MDA水平上升，體內抗氧化能力有所提高，與對照組相比，實驗組提高明顯，差異具有統計學意義，由此可發現烏頭提取物能夠增強抗氧化能力從而使的抗心衰效果明顯高于地高辛的應用效果。實驗研究表明烏頭提取物通過刺激心肌活性，可增強心率，進而增強心肌抗氧化能力。烏頭作為中草藥其藥理作用包括驅風活血，散痙止痛、麻醉敗毒、免疫調節、心血管作用和抗腫瘤作用［20-22］。從中醫角度心衰是由于心腎陽虛，瘀血、水停等引起，古代醫家應用烏頭等中藥進行治療，如今隨著醫療事業的發展中西結合治療對疾病的防治更為有效，研究人員對烏頭的有效成分進行提取，并利用烏頭提取物對心衰患者進行更有效的治療［23-24］。在心衰疾病過程中抗氧化能力的提升能夠使心衰機體維生素E增加，血液抗氧化活性加強，降低脂過氧化引發速度，能有效的保護心肌細胞，從而明顯改善心功能。由于本實驗中僅對烏頭提取物的作用做了初步研究，由于受到實驗研究條件的限制，因此對于本次實驗中所獲得的關于大鼠的研究結果是否具有代表性，有無種屬差異，其抗心衰效應與臨床作用是否能得到統一，以使烏頭提取物更好地服務于臨床，仍有待下一步的研究。

綜合本實驗研究結果，我們相信烏頭提取物能夠有效的改善心肌抗氧化能力從而達到治療心衰的目的，臨床有較好療效值得推廣。

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