異基因造血干細胞移植患者體內環孢素濃度測定及分析

葉 翀，李 俊，徐 濤，蘇 涌

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032;2.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，安徽合肥 230022)

環孢素A(Cyclosporine A，CsA)是一種選擇性作用于T淋巴細胞的強效免疫抑制劑，主要用于預防移植術后的移植物抗宿主反應或治療多種自身免疫病。CsA治療指數窄，治療劑量下生物利用度和體內代謝的個體差異較大，同多種藥物具有相互作用，能引起嚴重的不良反應。CsA的不良反應有:腎功能損害、膽紅素升高、高血壓、高血糖、頭痛、多毛、牙齦增生、脆甲、痤瘡、惡心、嘔吐、低鎂血癥、癲癇等［1］。作為移植物抗宿主病(GVHD)［2］預防方案的藥物之一，CsA的合理應用，尤其是其血藥濃度與干細胞移植患者療效及不良反應的相關性研究非常重要［3-4］。現使用高效液相色譜法(HPLC)［5-8］對我院2012—2014年間所進行的44例allo-HSCT患者635例次CsA血藥濃度進行監測并對結果予以分析，為更好地開展CsA濃度監測和臨床工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters alliance高效液相色譜儀(配備e2695 separation module，E10 SMH614G 柱溫箱，2489UV/Visible檢測器)，Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5μm);高速冷凍離心機 (長沙平凡儀器公司);AB135-5電子天平(上海梅特勒多-托利多公司);XW-80A渦旋振蕩器(上海醫科大學儀器廠);氮氣吹干儀(PGC-13D)。

1.2 試劑 環孢素A標準品(美國Sigma公司，59865-13-3);環孢素D標準品(美國Sigma公司，63775-96-2);乙腈(色譜純，Tedia公司);甲醇(色譜純，Tedia公司);叔丁基甲醚(分析純，Tedia公司);正己烷(分析純，Tedia公司);氫氧化鈉(分析純);鹽酸(分析純);超純水。

1.3 色譜條件 流動相:乙腈∶水=85∶15;檢測波長:214 nm;流速:1.2 mL·min-1;柱溫:65℃;進樣量:20μL。

1.4 溶液配制

1.4.1 環孢素A工作液配制 精密稱取環孢素A 10 mg，至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋溶解至刻度混勻，得1 000 mg·L-1的環孢素A儲備液Ⅰ。再精密量取環孢素A儲備液Ⅰ1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得100 mg·L-1的環孢素A儲備液Ⅱ。再精密量取環孢素A儲備液Ⅱ2.5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得25 mg·L-1的環孢素A工作液。

1.4.2 環孢素D工作液配制 精密稱取環孢素D 10 mg，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度混勻，得1 000 mg·L-1的環孢素D儲備液Ⅰ。再精密量取環孢素D儲備液Ⅰ1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得100 mg·L-1的環孢素D儲備液Ⅱ。再精密量取環孢素D儲備液Ⅱ5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得50 mg·L-1的環孢素D工作液。

1.4.3 氫氧化鈉溶液配制 精密稱取氫氧化鈉固體2 g，至500 mL容量瓶中，加水至刻度混勻，得0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液。

1.4.4 鹽酸溶液的配制 精密量取濃鹽酸4 mL至500 mL容量瓶中，加水至刻度混勻，得0.1 mol·L-1的鹽酸溶液。

1.5 樣品預處理 取全血樣品1 mL于15 mL具塞試管中，加內標工作液(環孢素D)10μL，0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL，渦旋混合2 min;加入叔丁基甲醚1.5 mL，渦旋混合2 min，離心(3 000 r·min-1)10 min，取上層醚液(重復兩次萃取);將上層有機相置于55℃水浴中氮氣吹干;加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液和50μL流動相復溶，渦旋混合2 min;加入500 mL正己烷，渦旋混合2 min，離心(6 000 r·min-1)10 min，棄去正己烷層，取下層試樣20μL進樣。

1.6 樣本納入標準 (1)患者年齡均大于15歲。(2)2012—2014年于我院血液內科首次進行造血干細胞移植的患者。(3)患者移植前3 d開始接收CsA治療，移植前1 d使CsA血藥濃度達到200～400μg·L-1。(4)檢測濃度均為移植后6個月內［4］。

2 結果

2.1 色譜分離 按照上述色譜條件進行測定，CsA和內標CsD峰形良好，CsA保留時間約為5.3 min，CsD保留時間約為6.2 min。見圖1。

2.2 標準曲線制定 配制濃度為 50、100、250、400、500、800、1 000 μg·L-1的 CsA 溶液，分別加入1 mL空白全血中，按1.5方法下進行樣品預處理后進樣，以CsA濃度為橫坐標(μg·L-1)，CsA與CsD比值為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程Y=0.003X-0.0293，R2=0.999 6，標準曲線如圖 2。

2.3 精密度實驗 分別配制250、500、800μg·L-1三個濃度的CsA溶液，分別加入1 mL空白全血中，按“1.5”方法下進行樣品前處理后進樣，各濃度每小時進一針，連續進5 h。連續5 d進行以上各濃度的進樣操作。各濃度CsA與CsD峰面積比為M，標準偏差SD，精密度RSD(%)=(SD/M)×100%。結果見表1，高中低三個濃度的日內RSD和日間RSD均小于10%，表明此方法精密可重現，可用于樣品測定。

表1 環孢素A精密度實驗(n=5，±s)

表1 環孢素A精密度實驗(n=5，±s)

濃度 C/μg·L-1日內精密度SCsA/SCsD SD RSD/%日內精密度SCsA/SCsD SD RSD/%250 0.78 ±0.01 0.013 1.64 0.76 ±0.02 0.024 3.16 500 1.47 ±0.02 0.017 1.16 1.44 ±0.05 0.054 3.74 800 2.45 ±0.04 0.038 1.57 2.41 ±0.07 0.071 2.93

2.4 回收率實驗 分別配制250、500、800μg·L-1三個濃度的CsA溶液各5份，分別加入1 mL空白全血中，按“1.5”方法下進行前處理后進樣，將結果帶入線性方程中，計算濃度C1，計算C1與標準濃度C的比值，即為方法回收率或相對回收率。

分別配制 250、500、800 μg·L-1三個濃度的CsA溶液各5份，分別加入1 mL空白全血中，按“1.5”方法下進行前處理后進樣，得到結果CsA峰面積S1;另用流動相分別配制 250、500、800 μg·L-1三個濃度的CsA溶液，直接進樣，得到結果CsA峰面積S。計算S1/S的比值，即為提取回收率或絕對回收率。見表2。

表2 環孢素A回收率實驗(n=5，±s)

表2 環孢素A回收率實驗(n=5，±s)

濃度 C/μg·L-1相對回收率C1/μg·L-1 C1/C×100/%絕對回收率S S1 S/S1×100/%250 254.54 ±2.44 101.82 ±0.97 26.23 ±0.51 28.592.05 ±1.80 500 491.39 ±4.45 98.14 ±0.98 52.50 ±1.21 57.2 91.78 ±2.12 800 773.17 ±10.88 96.65 ±1.37 93.97 ±3.04 99.694.34 ±3.05

2.5 樣品檢測 共測得符合納入標準患者44例，累計檢測環孢素濃度635例次。男性30例，女性14例;9例為中華骨髓庫無血緣關系外周血干細胞供體，5例為臍血干細胞供體，其余30例為患者同胞外周血干細胞供體。

2.6 CsA濃度分布 相關文獻報道CsA有效血藥濃度在200 ～400 μg·L-1之間［9］，所監測的 allo-HSCT患者CsA血藥濃度結果分布見表3。

表3 CsA濃度分布

2.7 CsA濃度與移植物抗宿主病(GVHD)的關系將患者CsA平均血藥濃度值分為兩組，＜200μg·L-1和≥200 μg·L-1，以 χ2檢驗兩組與發生GVHD概率的相關性。44例患者在移植后6個月內有19例患者出現GVHD反應，其中皮疹10例，口腔黏膜炎7例，腹瀉2例。分組比較發現，平均血藥濃度＜200μg·L-1的患者發生GVHD的概率大于平均血藥濃度＞200μg·L-1的患者組，χ2檢驗P＜0.05，有統計學意義。如表4。

表4 CsA濃度與GVHD發生率的關系

2.8 CsA濃度與藥品不良反應(ADR)的關系 將患者CsA平均血藥濃度值分為兩組，＜400μg·L-1和≥400μg·L-1，以 χ2檢驗兩組與發生 ADR概率的相關性。44例患者在移植后6個月內發生疑似CsA藥物性ADR 3例，都為肌酐升高和轉氨酶升高的肝腎功能損傷，減量或停藥后可恢復。分組比較發現血藥濃度 ＜400μg·L-1的患者組發生ADR概率小于血藥濃度＞400μg·L-1的患者組，χ2檢驗P＞0.05，沒有統計學意義。見表5。

表5 CsA濃度與ADR發生率的關系

3 討論

全血CsA濃度檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和熒光偏振免疫法(FPIA)［10-11］。FPIA法需要血藥濃度檢測儀(TDX)和試劑盒，價格較為昂貴，有效期短，以進口為主;而本法所需高效液相色譜儀相對較為普及，大多醫療機構都有，便于推廣應用。此外，由于本法測定成本低，減輕了患者的經濟負擔。本實驗建立的全血CsA濃度HPLC測定方法，重現性好、提取回收率高、變異系數小。本方法除本文已收納病例外，3年來共檢測全血環孢素濃度2 000余次，取得了良好的結果。本方法簡便、可行，可以廣泛的用于臨床血藥濃度監測。

本文研究結果顯示，接受allo-HSCT患者中，不同個體不同時期對CsA的敏感性和耐受性差異較大，臨床上應密切監測CsA血藥濃度，以防止濃度過低發生相關的移植物抗宿主病或濃度過高發生的藥品相關不良反應。在行allo-HSCT時，應盡量使患者的CsA血藥濃度維持在200～400μg·L-1范圍內［12］。

本研究涉及一家三甲醫院三年的Allo-HSCT患者，樣本量相對較少，只能就已知樣本初步研究CsA藥物濃度與患者出現GVHD、ADR之間的相關性。今后的研究中，還可以根據GVHD、ADR出現的時間點討論CsA濃度與術后各時間段的相關性，以及根據急性 GVHD的分級，研究 CsA濃度高低與GVHD各分級的相關性。其他研究還可包括CsA用藥劑量與濃度相關性，術前預處理方案與CsA濃度相關性，術后造血重建時間與CsA濃度相關性等［13-14］。

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