內蒙古漢族人群維生素D受體FokI基因多態性與斑禿的關系

卓 納張 滿辛 燕

·論著·

內蒙古漢族人群維生素D受體FokI基因多態性與斑禿的關系

卓 納1張 滿1辛 燕2?

目的: 明確維生素D受體FokI基因多態性與內蒙古漢族人群斑禿的相關性。方法: 運用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性分析(PCR－RFLP)技術，檢測105例斑禿患者與145名健康對照的維生素D受體基因FokI酶切位點的多態性。結果: 病例組維生素D受體FokI的3種基因型FF、Ff、ff頻率分別為0.324、0.524、0.152，對照組分別為0.297、0.531、0.172，兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。結論: 維生素D受體FokI基因多態性可能與內蒙古漢族人群斑禿的發病無關。

斑禿； 維生素D受體； FokI基因多態性

斑禿是一種臨床常見皮膚病，我國的患病率為0.27%。1典型表現為頭部出現單個或數個邊界清晰的圓形脫發斑。斑禿對患者的心理和生活質量均有影響。

維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)啟動毛發生長周期，保證各種信號轉導通路正常進行并促進毛囊干細胞增殖與分化，在毛發生長中發揮重要作用。2－5近年來學者們發現，6斑禿患者毛囊VDR的mRNA和蛋白表達均降低。VDR的活性和數量直接受VDR基因的調控，VDR基因的改變直接影響VDR生物學功能的實現。FokI作為與個體生長發育有關的VDR的基因多態性位點之一，其異常可導致VDR生物學功能的改變。本研究觀察正常對照組及斑禿患者VDR FokI基因多態性的差異，以探討VDR FokI基因多態性與斑禿的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 入選對象來自內蒙古醫科大學附屬醫院、內蒙古醫科大學第三附屬醫院、內蒙古包頭醫學院第一附屬醫院及內蒙古北方重工醫院皮膚科就診的斑禿患者105例(男57例，女48例)。入選標準為經臨床確診的斑禿患者，診斷標準選自Olsen等7制定的斑禿臨床診斷指南，入選前2個月內未接受全身糖皮質激素、免疫制劑和放射治療，排除其他類型脫發，如先天性脫發、生長期脫發、雄激素源性脫發以及瘢痕性脫發。排除伴發有與VDR FokI基因多態性相關的如骨質疏松、佝僂病、鉛中毒、前列腺癌、乳腺癌、尿結石等疾病。

病例組患者105例，男57例，女48例，年齡4～66歲，平均35.56±11.82歲。對照組為健康體檢人群145名，男75名，女70名，年齡7～64歲，平均37.14± 13.64歲，性別和年齡與病例組比較無統計學差異，與患者無親屬關系，所有健康人群經病史詢問及體格檢查后排除患病。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 取外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用鹽析法進行基因組DNA提取。

1.2.2 引物設計 引物序列:上游引物(P1):5′－AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT－3′；下游引物(P2):5′－ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC－3′。

1.2.3 PCR擴增體系與反應條件 PCR反應體系總體積20 μL，DNA模板(150 ng)2 μL，TaqDNA聚合酶(0.5U)0.5 μL，緩沖液10 μL，dNTP 2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL無菌去離子水3.5 μL。

PCR反應條件:94℃預變性2 min，94℃變性，25 s；復性62℃，35 s；延伸72℃ 45 s，35個循環，最后延伸10 min。

1.2.4 酶切體系及其反應條件 取PCR擴增產物10 μL，1 μL FokI限制性內切酶，10×Buffer緩沖液、0.1 BSA緩沖2 μL，去離子水5 μL，37℃水浴3 h。

1.2.5 電泳及結果分析 將2%瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加入足量的l×TBE電泳緩沖液，取20 μL PCR反應產物，加入到2%瓊脂糖凝膠的上樣孔。90伏恒壓電泳，30 min后在紫外凝膠成像分析儀上照相并作標記和存檔。分型標準:FF型為265 bp一個片段；Ff型為265 bp，196 bp，69 bp三個片段；基因型ff為196 bp，69 bp兩個片段。

1.3 統計學方法 統計學采用SPSS 16.0軟件分析。判讀樣本基因型并計算組內基因型例數，先用Hardy－Weinberg平衡原理估測樣本的群體代表性，再統計各組FokI的基因型及等位基因頻率，組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR產物酶切結果 經限制性內切酶FokI對PCR產物消化后電泳，顯示維生素D受體存在多態性。VDR基因有2個等位基因F和f，可組合形成FF、Ff、ff 3種基因型，見圖1。

2.2 Hardy－Weinberg平衡檢驗 病例組與對照組VDR FokI基因多態性位點經Hardy－Weinberg平衡檢驗，均無統計學顯著差異(均P＞0.05)。這表明，本研究選取的病例組和對照組個體能夠代表總體基因型分布規律，見表1。

表1 病例組與對照組VDR FokI基因多態性Hardy－Weinberg平衡檢驗結果

2.3 維生素D受體基因FokI基因型和等位基因頻率分布 病例組VDR FokI基因型和等位基因分布與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05)，見表2、表3。

圖1 VDR基因FokI位點酶切電泳結果

表2 病例組與對照組VDR FokI基因型分布頻率比較

3 討論

維生素D(vitamin D，VitD)為人體必須的一種維生素，為一組脂溶性類固醇衍生物，在紫外線和飲食的影響下在表皮角質形成細胞中合成，直接或間接調節腎及腸道鈣、磷代謝，組織細胞增殖、分化和凋亡。這些功能的發揮主要通過VDR介導。VDR是核受體，廣泛存在于骨骼、腎、腸道、皮膚等體內大多數組織和細胞，調控機體新陳代謝，也存在于毛囊角質形成細胞和真皮乳頭細胞，調控皮膚新陳代謝和毛囊生長周期。

近年的研究發現，VDR在斑禿的發病中發揮著重要作用，其活性與數量的改變直接影響斑禿的發生和發展。斑禿患者毛囊VDR的mRNA和蛋白表達均降低，分析其原因可能為以下幾點:(1)VDR使角質形成細胞增殖減慢，分化加快。缺少VDR會減慢角質形成細胞的分化和毛囊的生長，進而發生脫發；5(2)正常足量的VDR缺乏時，阻止β－連環蛋白與Lef1合，Wnt信號通路阻斷，導致毛囊發育異常；8(3)結合部位VDR DNA的缺少導致毛發生長周期啟動缺陷，導致生長期毛發減少，進而脫發；9(4)VDR敲除小鼠的 T細胞發生明顯的炎癥反應，學者們推測，VDR的減少誘導毛囊發生炎癥反應，使毛囊提前進入退行期，從而發生脫發。10

VDR基因調控VDR mRNA和蛋白表達，VDR的編碼基因位于常染色體12q，全長約75 kb，由9個外顯子和8個內含子組成。VDR有多個限制性內切酶位點，與個體生長發育及人類疾病相關的基因多態性有4個，分別對應限制性內切酶 FokI、BsmI、ApaI、TaqI的酶切位點。FokI內切酶多態性位點位于VDR基因第2外顯子，BsmI、ApaI內切酶多態性位點位于第8和第9外顯子之間的內含子內，TaqI位于第9外顯子中。這些內切酶多態性都可以影響VDR蛋白的數量和活性。

研究發現，VDR FokI基因多態性因人種和地區的不同出現不同多態性分布。FokI等位基因分布頻率在我國漢族人群中的頻率分布為F 47%，f 53%，在瑞士高加索人群為F 59%，f 40%，在日本人群中為F 62%，f 37%。鄭敏等11報道的廣西地區兒童VDR FokI基因型頻率為FF 29.85%、Ff 48.13%和ff 22.02%。盛開妍等12報道，我國上海地區漢族人口中FF、Ff和ff基因型頻率為40%、48.13%和11.88%。于利偉等13報道的西安地區漢族人口VDR FokI基因型頻率為FF 59%、Ff 30%和ff 11%。我們的結果中VDR FokI基因型頻率為FF 29.7%，Ff 53.1%，ff 17.2%，與鄭敏等報道的廣西地區基因型分布頻率接近，與盛開妍等報道的上海地區、于利偉等報道的西安地區分布頻率略有不同。

我們的研究顯示，內蒙古地區漢族人群VDR基因FokI基因多態性與斑禿無相關性，這與Akar等14對土耳其白種人25例斑禿和27例對照組進行的研究結果相一致。

1王婷琳，沈佚葳，周城，等.中國六城市斑禿患病率調查.中華皮膚科雜志，2009，42(10):668－670.

2 Lim YY，Kim SY，Kim DS，et al.Reduced expression of Vitamin D receptor(VDR)related to alopecia universalis by Wnt/b－catenin signaling pathway(Abst).Exp Dermatol，2010，19: 576.

3 Teichert A，Elalieh H，Bikle D，et al.Disruption of the hedgehog signaling pathway contributes to the hair follicle cycling deficiency in Vdr knockout mice.J Cell Physiol，2010，225(2):482－489.

4 Bikle DD.Vitamin D and the skin.J Bone Miner Metab，2010，28(2):117－130.

5 Luderer HF，Demay MB.The vitamin D receptor，the skin and stem cells.J Steroid Biochem Mol Biol，2010，121(1－2):314－316.

6蔡澤明，張斌，趙瑩，等.維生素D受體在斑禿皮損處毛囊的異常表達.廣東醫學，2011，32(10):1259－1262.

7 Olsen EA，Hordinsky MK，Price VH，et al.Alopecia areata investigational assessment guidelines－Part II.National Alopecia Areata Foundation.J Am Acad Dermatol，2004，51(3):440－447.

8 Cianferotti L，Cox M，Skorija K，et al.Vitamin D receptor is essential for normal keratinocyte stem cell function.Proc Natl Acad Sci，2007，104(22):9428－9433.

9 Sakai Y，Demay MB.Evaluation of keratinocyte proliferation and differentiation in vitamin D receptor knockout mice.Endocrinology，2000，141(6):2043－2049.

10 Froicu M，Weaver V，Wynn TA，et al.A crucial role for the vitamin D receptor in experimental inflammatory bowel diseases.Mol Endocrinol，2003，17(12):2386－2392.

11鄭敏，羅建明.廣西地區兒童維生素D受體基因Fok工位點多態性分布研究.臨床兒科雜志，2010，28(11):1061－1063.

12盛開妍，張薇薇，游利，等.上海地區漢族人群維生素D受體基因多態性與1型糖尿病的相關性研究.中國糖尿病雜志，2009，17(9):666－668.

13于利偉，王世捷，郭建新，等.西安地區青少年骨密度值及其與維生素D受體基因多態性的研究.西安交通大學學報(醫學版)，2005，29(l):115－117.

14Akar A，Orkunoglu FE，Ozata M，et al.Lack of association between Vitamin D receptor FokI polymorphism and alpopecia areata.Eur J Dermatol，2004，14(3):156－158.

(收稿:2014－08－14 修回:2014－08－24)

Relationship between vitamin D receptor gene FokI polymorphism and alopecia areata in Inner Mongolian Han population

ZHUO Na，ZHANG Man，XIN Yan.Affiliated Hospital of Inner Mongolian Medical University，Inner Mongolian，Hohhot，010050

Objective:To determine the relationship between the polymorphism of vitamin D receptor gene FokI and alopecia areata in Inner Mongolia Han population.Methods:The polymorphism of vitamin D receptor Gene FokI sites in patients with alopecia areata(105 patients)and healthy controls(145 patients)were detected by PCR－RELP.Results:The genotype frequencies of FF，Ff and ff in patients were 0.324，0.524，0.152 and those in healthy controls were 0.297，0.531，0.172.There were no significant difference between the patients and the controls(P＞0.05).Conclusion:There is no relationship between the polymorphism of vitamin D receptor FokI and alopecia areata in Inner Mongolia Han population.

alopecia areata；vitamin D receptor；FokI polymorphism

1內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科，內蒙古呼和浩特，010050 2內蒙古醫科大學第三附屬醫院皮膚科，內蒙古包頭，014010

?通信作者