白藜蘆醇對UVA照射人成纖維細胞的光保護作用

雷 衛陳 凰徐學剛李遠宏吳 嚴?

·論著·

白藜蘆醇對UVA照射人成纖維細胞的光保護作用

雷 衛1，2陳 凰1，3徐學剛1李遠宏1吳 嚴1?

目的: 明確白藜蘆醇對長波紫外線(UVA)照射人成纖維細胞的光保護作用。方法: 細胞培養后，分為UVA組、UVA＋0.01 mmol/L白藜蘆醇組、0.01 mmol/L白藜蘆醇組及空白對照組。采用MTT法檢測細胞增殖活性，ELISA法檢測上清液中白介素(IL)－1β蛋白水平，RT－PCR檢測細胞中核因子－κB(NF－κB)、基質金屬蛋白酶(MMP)－1，－3的mRNA水平。結果: 0.01mmol/L白藜蘆醇組可提高UVA照射引起的細胞增殖活性的降低，降低UVA照射引起的IL－1β蛋白及細胞NF－κB、MMP－1和MMP－3mRNA的高表達。結論: 0.01mmol/L白藜蘆醇可能通過抑制IL－1β和NF－κB及其介導的MMPs表達，從而抑制UVA照射對人成纖維細胞造成的光損傷。

白藜蘆醇； 長波紫外線； 成纖維細胞

照射到地球表面的紫外線包括95%～98%的UVA和2%～5%的UVB。盡管UVA和UVB照射都會引起光老化，但UVA的劑量是UVB的10～1000倍，而且UVA照射一般深達真皮而作用于皮膚成纖維細胞。1紫外線照射可引起皮膚細胞的DNA損傷，是各種類型皮膚腫瘤的主要環境危險因素。2細胞核因子－κB(NF－κB)是一種與炎癥有關的核轉錄因子，它可被紫外線和炎癥因子激活，誘發IL－1、TNF－α、基質金屬蛋白－1(MMP－1)等的表達。3UVA直接照射于人成纖維細胞可誘發MMP－1和MMP－3基因水平和蛋白水平的高表達，4，5從而導致膠原蛋白質量和數量的變化。6UVA照射還可誘發活性氧族(ROS)包括過氧化氫、超氧陰離子、單線態氧、羥基自由基、一氧化氮等的蓄積。7單線態氧可誘發IL－1的產生，8進而提高ROS活性，9，10最后誘導MMP－1和MMP－3高表達。4，11

白藜蘆醇是自然界中的重要多酚類抗氧化劑，具有抗癌活性。12，13在白藜蘆醇化學防護過程中，NF－κB、前炎癥因子和MMPs等因子進行了不同程度的參與。有研究表明，白藜蘆醇可通過干擾NF－κB活性調節人類角質形成細胞的炎癥反應。14體外研究發現，白藜蘆醇可通過抑制NF－κB的抑制蛋白(IκB)磷酸化和降解來阻斷IL－1β刺激的人軟骨細胞NF－κB p65亞單位活性。15體外研究發現，白藜蘆醇可通過在mRNA和蛋白水平作用于MMP－1和MMP－3來發揮其抗炎和抗異化作用。15本研究中，我們將白藜蘆醇加入到UVA照射的人成纖維細胞培養液中，檢測與MMPs相關指標mRNA和蛋白水平的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基、胎牛血清、DS培養基(DMEM＋10%胎牛血清)；胰蛋白酶(Hyclone公司，日本)；白藜蘆醇(純度＞98%，雅詩蘭黛公司，美國)；ELISA試劑盒(R＆D，美國)；噻唑藍(MTT)；SSA－01型UVA照射儀(上海希格瑪高技術有限公司，照射強度3.2 mW/cm2)；550型酶標儀(Bio－Ran Laboratories Inc.，Hercules，加拿大)；二氧化碳培養箱(BB16，德國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取健康人包皮環切術后包皮組織，用含雙抗(青霉素100 000 U/L、鏈霉素100 mg/L)的PBS緩沖液漂洗3次，在無菌條件下用眼科剪盡量剔除皮下脂肪組織，剪成0.5 cm×0.5 cm的皮片，加入0.25%的胰蛋白酶4℃消化過夜。次日分離真表皮，將真皮部分剪碎后加入適量0.25%的胰蛋白酶37℃消化5 min，加入完全培養基終止消化，200目尼龍網過濾，過濾后的細胞1000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量完全培養基接種在25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養箱孵育。每3天換液1次，約3天左右可見貼壁的梭形成纖維細胞，2周左右單層梭形的成纖維細胞鋪滿瓶底。用0.25%的胰蛋白酶1∶2消化傳代，取第4代對數生長期細胞用于進一步的實驗。

1.2.2 檢測白藜蘆醇對細胞增殖的影響 實驗分為UVA組、UVA＋0.01mmol/L白藜蘆醇組、白藜蘆醇組及空白對照組。制備5×104/mL的細胞懸液，每孔200μL接種于96孔板。UVA組、UVA＋0.01 mmol/L白藜蘆醇組:UVA照射光源與細胞間距離為15 cm，UVA照射劑量為5 J/cm2，UVA照射時吸去培養基，加少量PBS緩沖液，照射結束后吸棄PBS緩沖液，按上述實驗分組即刻加入含終濃度為0、0.01 mmol/L白藜蘆醇(母液為200 mmol/L，二甲基亞砜配制)的DS培養基200μL。白藜蘆醇組:加入含終濃度為0.01 mmol/L白藜蘆醇(母液為200 mmol/L，二甲基亞砜配制)的DS培養基200μL。每組設6個復孔，繼續培養6、24、48、72 h后，采用MTT法檢測:加入MTT液(5 g/L，PBS配制)20μL，繼續孵育4 h，棄去孔內培養基，加入150μL DMSO，避光震蕩10min，直到紫藍色沉淀完全溶解，于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度(A值)。獨立重復實驗3次。細胞存活率＝(實驗組A值－調零孔A值)/(空白對照組A值－調零孔A值)×100%。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL－1β分泌量 制備密度為5×104/mL的細胞懸液，定量接種于6孔板，按上述分組要求處理細胞，每組3個復孔。繼續培養6、24、48、72 h后收集細胞上清液，將上清液按照試劑說明書要求加入已包被抗體的96孔板中，于酶標儀450 nm波長處讀取A值。

1.2.4 RT－PCR檢測體外培養成纖維細胞NF－κB、MMP－1、MMP－3 mRNA水平 細胞用PBS洗3次，使用RNAisoTMPlus試劑盒提取總RNA。據逆轉錄說明書，根據總RNA量加入適量的5×PrimeScriptR RTMster Mix及RNase－free水。反轉錄反應條件: 37℃15 min，85℃ 5 s，4℃。將所有的樣本濃度調整至相當于RNA濃度30 ng/μL。在含有反轉錄產物的PCR反應液中，分別加入NF－κB、MMP－1、MMP－3引物。NF－κB引物:上游引物5'CGCATCCAGACCAACAACAACC－3'，下游引物5'AGAGCCGCACAGCATTCAGG－3'；MMP－1引物:上游引物5'CATGCCATTGAGAAAGCCTTCC－3'，下游引物 5'AGAGTTGTCCCGATGATCTCC－3':MMP－3引物:上游引物5'GACAAAGGATACAACAGGGACCAAT－3'，下游引物 5' TGAGTGAGTG ATAGAGTGGGTACAT－3'；β－actin做內參照引物，上游引物5'TGCGTTACACCCTTTCTTG－3'，下游引物5'ACCTTCACCGTTCCAGTTT－3'。PCR反應體積為25μL。反應條件:預變性95℃ 30 s，循環條件為:95℃ 10 s、60℃ 30 s，共40個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統掃描成像擴增產物。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件包進行統計分析，所有數據以ˉx±s表示。采用單因素方差分析進行檢驗，多重比較采取SNK檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖率 0.01 mmol/L白藜蘆醇對正常人成纖維細胞的細胞增殖活性無影響。UVA照射后6 h時細胞增殖率較空白對照降低大約10%，24 h時恢復至接近正常，48 h和72 h又下降至很低水平。0.01 mmol/L白藜蘆醇加入UVA照射的細胞后，各個時間點的細胞增殖活性均得到了很好的保護(圖1，圖2)。

2.2 細胞因子IL－1β測定 空白對照組和白藜蘆醇組的細胞上清液中IL－1β蛋白水平接近，且各個時間點之間無統計學差異(P＞0.05)。UVA照射后，IL－1β蛋白水平在相應時間點上升了近15%(P＜0.05)，48 h時達高峰。0.01 mmol/L白藜蘆醇加入UVA照射的細胞后，這種高水平又降至正常水平。(圖3)

圖1 MTT檢測細胞增殖活性

2.3 RT－PCR檢測結果

圖2 倒置相差顯微鏡下人成纖維細胞形態(6 h時)

2.3.1 NF－κB 與空白對照組和白藜蘆醇組相比，UVA組的NF－κBmRNA表達在6 h和24 h時顯著升高約40%(P＜0.05)，48 h進一步升高，72 h時回落至正常水平(P＞0.05)。加入0.01 mmol/L白藜蘆醇后，可在6 h、24 h和48 h逆轉上述高表達。(圖4)

2.3.2 MMP－1和MMP－3 各個時間點上，空白對照組和白藜蘆醇組的MMP－1 mRNA和MMP－3 mRNA無明顯差異(P＞0.05)。UVA照射后，這兩個指標的mRNA表達顯著升高，從6 h至48 h呈現正弦曲線趨勢(高峰在24 h)。其中，MMP－1升高約85%，MMP－3升高約65%。72 h時，MMP－1 mRNA回落至正常水平，而MMP－3 mRNA反彈至較高水平。經0.01 mmol/L白藜蘆醇處理后，MMP－1 mRNA水平在6 h至48 h得到了很好的抑制；而MMP－3 mRNA水平則在24 h至72 h被顯著抑制(P＜0.05)。(圖5)

圖3 ELISA檢測細胞上清液中IL－1β蛋白表達

圖4 RT－PCR檢測細胞NF－κB mRNA表達

圖5 RT－PCR檢測細胞MMP－1mRNA和MMP－3mRNA表達

3 討論

目前越來越多的研究證實白藜蘆醇具有光保護作用，如抑制、延遲或逆轉紫外線照射引起的破壞作用。然而，白藜蘆醇存在不穩定的缺點，因為它容易轉化成非活性的cis－形式(尤其在接受紫外線照射后更是如此)，16，17且其自由基清除的特性使得它對于外源性的ROS更敏感。修飾白藜蘆醇結構可增強白藜蘆醇光保護作用和穩定性，有學者將白藜蘆醇類似物加入到一種中性洗劑中，其光保護因子(SPF)和UVA保護因子均較之前有所增加，在另一項研究中，多酚甲基化有效地阻止了代謝結合反應，從而很大程度地增加了白藜蘆醇的穩定性。182007年，有學者推出了一種新型白藜蘆醇，即三磷酸白藜蘆醇。這種白藜蘆醇在角質層酸性磷酸鹽的幫助下，通過滲透入皮膚并且轉換成白藜蘆醇原型而有效地傳遞活性復合物進入皮膚組織。19我們的前期研究將這種白藜蘆醇外涂于日光模擬器照射的人體皮膚上，發現其可通過抑制日曬傷細胞形成和降低黑素形成來減輕日曬傷和曬黑。20本研究對此種白藜蘆醇對UVA照射人成纖維細胞光保護作用進行了初步的實驗研究。

本研究中，僅給予白黎蘆醇處理的成纖維細胞與空白對照組細胞的增殖活性相近，提示0.01 mmol/L白黎蘆醇對細胞無毒性，安全性好。經單次5 J/cm2UVA照射后，6 h時成纖維細胞的增殖活性即受到抑制，24 h時回復到接近正常水平，此后又被抑制。24 h時的回復可能是一種反饋機制在起作用，因為細胞內線粒體功能在UVA照射短期內會更加活躍，在此時間段更多的外源性MTT經琥珀酸脫氫酶還原成了不溶性的紫色結晶物。21但是隨著時間推移這種作用被UVA后續破壞作用壓倒，因此細胞增殖率在24 h以后進一步下降，直至72 h仍未能回復。加入0.01 mmol/L白黎蘆醇至UVA照射的成纖維細胞后，上述4個時間點的細胞增殖活性均得到了很好的保護。

Gonzales等提出白黎蘆醇和姜黃素可下調脂肪細胞TNF－α介導的NF－κB途徑。22Jha的研究亦發現白黎蘆醇可抑制嚴重急性胰腺炎患者NF－κB活性及與之密切相關的細胞因子IL－1和TNF－α。23Gonzales認為抗氧化劑的這種抑制作用可能是通過抑制NF－κB p65亞單位的核遷移和IκB降解而發揮作用，最終導致炎癥因子如IL－1β和TNF－α等生成減少。22在我們的研究中，0.01 mmol/L白黎蘆醇于6 h、24 h和48 h顯著抑制了UVA照射誘導的成纖維細胞NF－κB mRNA高表達。UVA照射后6 h和24 h上清液中IL－1β蛋白呈現高表達，且一直持續到照射后72 h，0.01 mmol/L白黎蘆醇加入后可顯著抑制這種高表達。上述結果提示白黎蘆醇可能通過抑制NF－κB及IL－1β發揮抵御光損傷的作用，與以往的研究結果一致。

還有研究表明，IL－1β可上調脂肪細胞內MMP－1 mRNA和MMP－3 mRNA的表達，而白黎蘆醇可劑量依賴地抑制TNF－α誘發的MMP－1和MMP－3產生。24，25SIRT1是一種天然的白黎蘆醇激活劑，可下調人類真皮成纖維細胞MMP－1和MMP－3表達。26我們的研究中，0.01 mmol/L白黎蘆醇顯著地抑制了成纖維細胞MMP－1 mRNA(6～48 h)和MMP－3 mRNA (24～72 h)的表達。上述結果與以往研究結果均提示白黎蘆醇可能通過抑制IL－1β及與其密切相關的MMP－1和MMP－3發揮細胞保護作用。

綜上所述，0.01 mmol/L白黎蘆醇通過保護細胞增殖活性、下調IL－1β蛋白分泌、下調NF－κB、MMP－1及MMP－3 mRNA表達，逆轉UVA照射誘導的人成纖維細胞光損傷，從而發揮抗光老化作用。

1Meunier L.Ultraviolet light and dendritic cells.Eur JDermatol，

1999，9(4):269－275.

2 Mason RS，Reichrath J.Sunlight vitamin D and skin cancer.Anticancer Agents Med Chem，2013，13(1):83－97.

3 Tanaka YT，Tanaka K，Kojima H，et al.Cynaropicrin from Cynara scolymus L.suppresses photoaging of skin by inhibiting the transcription activity of nuclear factor－kappa B.Bioorg Med Chem Lett，2013，23(2):518－523.

4 Gao D，Bing C.Macrophage－induced expression and release of matrix metalloproteinase 1 and 3 by human preadipocytes ismediated by IL－1 beta via activation of MAPK signaling.J Cell Physiol，2011，226(11):2869－2880.

5 Kut C，Hornebeck W，Groult N，et al.Influence of successive and combined ultraviolet A and B irradiations on matrix metalloelastases produced by human dermal fibroblasts in culture. Cell Biol Int，1997，21(6):347－352.

6 Kohl E，Steinbauer J，Landthaler M，et al.Skin ageing.JEur Acad Dermatol Venereol，2011，25(8):873－884.

7 Narayanapillai S，Agarwal C，Tilley C，et al.Silibinin is a potent sensitizer of UVA radiation－induced oxidative stress and apoptosis in human keratinocyte HaCaT cells.Photochem Photobiol，2012，88(5):1135－1140.

8W laschek M，Wenk J，Brenneisen P，et al.Singlet oxygen is an early intermediate in cytokine－dependent ultraviolet－A induction of interstitial collagenase in human dermal fibroblasts in vitro. FEBSLett，1997，413(2):239－242.

9 Chi PL，Chen YW，Hsiao LD，etal.Heme oxygenase 1 attenuates interleukin－1β－induced cytosolic phospholipase A 2 expression via a decrease in NADPH oxidase/reactive oxygen species/activator protein 1 activation in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.Arthritis Rheum，2012，64(7):2114－2125.

10 Kojima H，Kunimoto H，Inoue T，et al.The STAT3－IGFBP5 axis is critical for IL－6/gp130－induced premature senescence in human fibroblasts.Cell Cycle，2012，11(4):730－739.

11 Zaw KK，Yokoyama Y，Abe M，etal.Catalase restores the alteredmRNA expression of collagen andmatrixmetalloproteinases by dermal fibroblasts exposed to reactive oxygen species.Eur JDermatol，2006，16(4):375－379.

12 Caddeo C，Teskac K，Sinico C，et al.Effect of resveratrol incorporated in liposomes on proliferation and UV－B protection of cells.Int JPharm，2008，363(1－2):183－191.

13 Signorelli P，Ghidoni R.Resveratrol as an anticancer nutrient: molecular basis，open questions and promises.JNutr Biochem，2005，16(8):446－449.

14 Potapovich AI，Lulli D，Fidanza P，et al.Plant polyphenols differentiallymodulate inflammatory responses of human keratinocytes by interfering with activation of transcription factors NFkappaB and AhR and EGFR－ERK pathway.Toxicol Appl Pharmacol，2011，255(2):138－149.

15Wuertz K，Quero L，SekiguchiM，etal.The red wine polyphenol resveratrol shows promising potential for the treatment of nucleus pulposus－mediated pain in vitro and in vivo.Spine (Phila Pa 1976)，2011，36(21):E1373－1384.

16 Aggarwal BB，Bhardwaj A，Aggarwal RS，et al.Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer:preclinical and clinical studies.Anticancer Res，2004，24(5A):2783－2840.

17Mendes JB，Riekes MK，de Oliveira VM，et al.PHBV/PCL microparticles for controlled release of resveratrol:physicochem ical characterization，antioxidant potential，and effect on hemolysis of human erythrocytes.ScientificWorldJournal，2012，2012:542937.

18PoloniniHC，Lima LL，Goncalves KM，et al.Photoprotective activity of resveratrol analogues.Bioorg Med Chem，2013，21 (4):964－968.

19 Lee JS，Park KY，Min HG，et al.Negative regulation of stress－induced matrix metalloproteinase－9 by Sirt1 in skin tissue. Exp Dermatol，2010，19(12):1060－1066.

20Wu Y，Jia LL，Zheng YN，et al.Resveratrate protects human skin from damage due to repetitive ultraviolet irradiation.J Eur Acad Dermatol Venereol，2013，27(3):345－350.

21Ray RS，Agrawal N，Sharma A，et al.Use of L－929 cell line for phototoxicity assessment.Toxicol In Vitro，2008，22(7): 1775－1781.

22 Gonzales AM，Orlando RA.Curcumin and resveratrol inhibit nuclear factor－kappaB－mediated cytokine expression in adipocytes.Nutr Metab(Lond)，2008，5:17.

23 Jha RK，Ma Q，Sha H，et al.Emerging role of resveratrol in the treatment of severe acute pancreatitis.Front Biosci(Schol Ed)，2010，2:168－175.

24Moon MH，Jeong JK，Lee YJ，etal.SIRT1，a class IIIhistone deacetylase，regulates TNF－alpha－induced inflammation in human chondrocytes.Osteoarthritis Cartilage，2013，21(3):470－480.

25 Toegel S，Wu SQ，Otero M，et al.Caesalpinia sappan extract inhibits IL1beta－mediated overexpression ofmatrix metalloproteinases in human chondrocytes.Genes Nutr，2012，7(2):307－318.

26Ohguchi K，Itoh T，Akao Y，et al.SIRT1 modulates expression of matrix metalloproteinases in human dermal fibroblasts. Br JDermatol，2010，163(4):689－694.

(收稿:2014－11－10 修回:2014－11－17)

Protective effects of resveratrol on photo－damage of human fibroblasts induced by UVA

LEIWei，CHEN Huang，XU Xue-gang，et al.Department ofDermatology，No.1 Hospital ofChina Medical U-niversity，Shenyang，110001

Objective:To determine the protective effects of resveratrol on photo－damage of human fibroblasts induced by UVA.M ethods:Human fibroblastswere random ly divided into UVA group，0.01 mmol/L resveratrol group，UVA combined with 0.01mmol/L resveratrol group and blank control group.The proliferation of fibroblastswas detected by MTT.The level of IL－1βprotein was detected by ELISA.The levels ofmRNA expression of NF－κB，MMP－1，－3 weremeasured by RT－PCR.Results:0.01 mmol/L resveratrol increased the level of fibroblasts proliferation which decreased after UVA－induced and decreased the levels of IL－1βprotein，NF－κB and MMP－1，－3mRNA which increased after UVA－induced.Conclusion:Themechanism of the protective of resveratrol on the photo－damage of human fibroblast induced by UVA may be through regulating the expression of IL－1β，NF－κB and MMPs.

resveratrol；UVA；fibroblast

國家自然科學基金(青年科學基金項目)(編號:81301388)

1中國醫科大學附屬第一醫院皮膚科，沈陽，110001 2武漢市中西醫結合醫院(武漢市第一醫院)皮膚科，武漢，430000 3深圳市天美醫療美容醫院激光科，深圳，518000?通信作者