時鐘基因啟動子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變①

祝艷秋，陸璐，李林，蔡彥寧，張蘭

時鐘基因啟動子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變①

祝艷秋1a，陸璐1a，李林1a，蔡彥寧1b，張蘭1a

目的探索時鐘基因啟動子甲基化頻率增齡性改變及其在衰老中的作用。方法4月齡(青年組，n=9)、20月齡(老年組，n=10)C57BL小鼠，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應方法檢測小鼠胃、脾、血管、腎、紋狀體中時鐘基因Per1/2、Bmal1/2、Cry1/2、Clock、Npas2啟動子甲基化水平。結果老年組脾組織Cry1、Bmal2和NPas2啟動子區甲基化頻率高于青年組(P＜0.05)，胃組織Per1基因啟動子甲基化頻率低于青年組(P＜0.05)，血管組織Bmal1啟動子區甲基化頻率高于青年組(P＜0.05)。結論多種時鐘基因啟動子甲基化可能參與衰老進程，并具有組織特異性。

衰老；晝夜節律；時鐘基因；啟動子甲基化

[本文著錄格式]祝艷秋，陸璐，李林，等.時鐘基因啟動子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變[J].中國康復理論與實踐, 2015,21(5):514-518.

CITED AS:Zhu YQ,Lu L,Li L,et al.Tissue-specific changes of clock DNA promoter methylation with aging[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):514-518.

晝夜節律是生物體內廣泛存在的一種生命時鐘，其周期約為24 h，它可以在分子生物學、生理學水平對大腦及外周等各種器官組織功能產生影響。研究顯示，衰老能夠導致晝夜節律異常，包括活動高峰幅度降低以及節律丟失；時鐘基因表達及功能紊亂也影響衰老相關疾病，如老年健康女性發生晝夜活動節律減少，此類節律的延后將增加其患癡呆癥和輕度認知障礙的風險，增加其死亡風險[1-3]。

晝夜節律由多種時鐘基因，如Per1/2、Cry1/2、 Clock、Npas2、Bmal1/2等控制[4]。時鐘基因具有節奏性的表達由相互關聯的轉錄反饋/前饋回路產生，從而驅動生理和行為節律[5-6]。時鐘基因DNA啟動子CpG島區域甲基化是基因轉錄的主要調控方法之一。有研究證實，時鐘基因啟動子甲基化水平升高能抑制基因表達[7]。目前已有研究發現，衰老相關疾病患者體內存在部分時鐘基因甲基化異常，如帕金森病患者體內Npas2基因啟動子甲基化水平顯著降低[8-9]。

以前的研究證實，在C57小鼠組織中存在多種時

鐘基因啟動子的甲基化[10]。本研究觀察C57衰老小鼠不同組織時鐘基因啟動子甲基化的增齡性改變，探索時鐘基因啟動子甲基化在衰老過程中的作用，以及時鐘基因啟動子甲基化在中樞和外周組織中的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

Wizard DNA purification resin：PROMEGA公司。CpG甲基化酶SssI：NEW ENGLAND BIOLAB公司。HS Taq：TAKARA公司。引物合成：上海生工生物有限公司。

1.2 動物

雄性C57BL/6J小鼠，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，SPF級，許可證號SCXK(軍)2007-004。3月齡小鼠10只飼養17個月至20月齡，作為老年組。老年組飼養至19月齡時，另購入3月齡小鼠9只飼養1個月至4月齡作為青年組。明暗時間為12 h∶12 h，室溫恒溫23℃，任意攝取水食。

1.3 取材

所有小鼠至預定月齡后，于同一時間點全部處死。取小鼠新鮮組織胃、血管、脾、腎及紋狀體，凍存于-80℃待用。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈式反應

按TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取小鼠基因組DNA。使用偏重亞硫酸鈉和對苯二酚對基因組DNA進行處理，使未發生甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶則未發生轉化。采用在線軟件(www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)分析時鐘基因Per1/2、Cry1/2、Clock、Npas2、Bmal1/2的啟動子序列，并用該軟件設計每個時鐘基因的甲基化引物和非甲基化引物各一套[11]。DNA啟動子區域出現部分甲基化以“PM”表示，未出現甲基化以“U”表示。

1.5 統計學分析

數據處理采用SPSS 16.0軟件。采用Fisher確切概率法對各組不同部位8種時鐘基因的甲基化頻率分別進行比較。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 紋狀體

青年組Cry1、Cry2啟動子甲基化，老年組Cry1啟動子甲基化。老年組Cry1和Cry2甲基化率與青年組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 脾

青年組各時鐘基因啟動子均無甲基化，老年組Cry1、Bmal2和Npas2啟動子區甲基化率比青年組升高(P＜0.05)。見表2。

表1 兩組小鼠紋狀體時鐘基因啟動子區甲基化水平(n)

表2 兩組小鼠脾組織時鐘基因啟動子區甲基化水平(n)

2.3 胃

青年組和老年組Per1、Cry1和Bmal1啟動子均有甲基化。老年組Per1啟動子甲基化率降低(P＜0.05)，而Cry1和Bmal1啟動子甲基化率與青年組相比無顯著

性差異(P＞0.05)。見表3。

2.4 血管

青年組Bmal1、Bmal2啟動子甲基化，老年組Cry1、Cry2、Bmal1啟動子甲基化，老年組Bmal1甲基化率比青年組升高(P＜0.05)。見表4。

表3 兩組小鼠胃組織時鐘基因啟動子區甲基化水平(n)

表4 兩組小鼠血管組織時鐘基因啟動子區甲基化水平(n)

2.5 腎

青年組Cry1和Bmal2啟動子甲基化，老年組Cry1啟動子甲基化，兩組各基因啟動子甲基化率均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表5 兩組小鼠腎組織時鐘基因啟動子區甲基化水平(n)

3 討論

近年研究發現，衰老個體及衰老相關疾病患者體內出現晝夜節律的異常[12]。晝夜節律由多種時鐘基因調控[4]，其DNA啟動子CpG島區域甲基化是基因轉錄的表觀遺傳主要調控方法之一[13]。檢測時鐘基因的RNA水平是研究基因表達水平較直接的手段，但由于RNA檢測對于樣本提取的要求較高，導致該法的應用較為局限。已有文獻證實，DNA甲基化水平增高能夠抑制基因表達[7]，因此，本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)檢測DNA甲基化水平，間接反映基因表達的變化。該法對樣本要求較低，操作快速簡單，具有更高的使用價值。由于MSP為定性檢測，我們通過比較樣本中甲基化的發生頻率，檢測DNA啟動子CpG島區域甲基化水平差異。

Cry基因是生物鐘基因負反饋環的主要成員[14]。Cry基因所表達的隱花色素(Cryptochrome)是一種感光受體，能夠調節植物的生長和發育，以及動植物的生物節律[15]。以往研究發現，衰老果蠅Cry基因mRNA和蛋白表達均顯著減少[16]。Cry1和Cry2缺陷小鼠作為衰老模型，與野生型小鼠相比不僅認知功能降低，而且睡眠周期紊亂[17]。本研究顯示，Cry1啟動子甲基化在老年組中樞神經組織和外周組織中均出現，尤其在衰老小鼠脾中，Cry1啟動子甲基化頻率比青年組增

高。已有證據顯示，DNA的甲基化能夠導致不可逆的啟動子沉默，從而下調基因表達[7]。有研究證實，Cry1和Cry2的減少能夠導致脾細胞中腫瘤壞死因子-α和活化的CD3+/CD69+T細胞增多[18]。脾組織Cry1啟動子甲基化增高，下調Cry1表達，可能加速免疫系統的衰老進程。

Bmal1在時鐘基因轉錄-翻譯反饋環路中起正向調節作用，它與視交叉上核以及外周時鐘細胞的生物節律高度相關[19]。已有研究指出，Bmal1功能障礙會導致生物鐘紊亂，且Bmal1缺失(Bmal1-/-)小鼠壽命減少，過早表現出衰老相關的表型[20-21]。研究證實，Bmal1基因缺失能在衰老過程中輕度影響血管促凝和抗凝途徑，隨著衰老進程，內皮功能障礙增加，血栓形成風險增加[22]。Bmal1啟動子甲基化在血管組織中增加，下調Bmal1基因表達，可能引起衰老相關血管疾病。

作為Bmal1的旁系同源物，Bmal2同樣被證實與衰老相關。近期一項研究顯示，Bmal2的基因多態性與中國人對阿爾茨海默病的易感性相關[23]。Bmal2在帕金森病患者特定時間的白細胞中表達水平降低，提示Bmal2與衰老或疾病引起的免疫細胞功能異常相關[24]。本研究顯示，Bmal2啟動子甲基化頻率在老年小鼠脾組織中明顯升高，導致Bmal2在脾組織中表達降低，可能加速脾組織衰老進程。有待進一步探究。

Npas2最初在哺乳動物前腦中發現，但已被證明在外周組織中同樣表達[25]。它作為生物節律轉錄因子，與Bmal1形成二聚體，激活其他核心時鐘基因[26]。研究證實，Npas2與衰老存在聯系，Npas2與Clock基因共同減少能夠導致衰老相關的神經退行性病變[27]。有研究指出，風濕性關節炎患者體內Npas2的表達延遲，影響白細胞介素的節律性生產，在諸多時鐘基因中，它是與人體免疫炎癥狀態最相關的基因之一[28]。Npas2在衰老脾組織中甲基化頻率增加，下調脾中Npas2的表達，可能導致免疫系統老化，從而引起免疫相關疾病。

Per1是時鐘基因負反饋調控的主要轉錄因子之一，它與Cry基因相互作用后抑制Clock/Bmal1二聚體的轉錄活性[29]。Per1基因不僅是主要的時鐘基因，其表達存在節律性并且與衰老高度相關[30-31]。目前針對Per1作用于衰老的研究較少。本研究顯示，衰老小鼠胃組織中Per1基因啟動子甲基化頻率低于青年組，表明衰老小鼠胃組織Per1表達增加，可能引起衰老所致的胃功能減退。

我們的研究顯示，衰老小鼠脾、胃和血管組織中均出現時鐘基因啟動子甲基化頻率的改變，特別是在衰老小鼠脾組織中，Cry1、Bmal2、Npas2的甲基化頻率均顯著減少，提示時鐘基因甲基化改變可能與免疫系統的老化相關性較高。此外，衰老小鼠胃組織Per1啟動子甲基化頻率降低，血管組織Bmal1啟動子甲基化頻率升高，而中樞神經組織紋狀體中并未出現甲基化頻率的改變。基于以上結果，我們的研究提示，時鐘基因啟動子在衰老小鼠不同組織中甲基化頻率的改變存在差異，時鐘基因啟動子甲基化的增齡性改變具有組織特異性。

紋狀體作為中樞神經組織，其時鐘基因甲基化水平與外周的脾、胃和血管組織存在明顯差異。衰老小鼠模型中樞組織時鐘基因啟動子甲基化發生率較低，而外周組織時鐘基因甲基化發生率較高。雖然有研究發現，衰老小鼠、大鼠以及阿爾茨海默病患者腦組織整體基因組DNA甲基化水平有所降低[32]，但目前尚無針對衰老個體中樞組織時鐘基因啟動子CpG島甲基化的研究報道。我們認為，衰老小鼠中樞組織時鐘基因啟動子CpG島甲基化可能不是導致其晝夜節律改變的主要因素。

綜上所述，衰老小鼠時鐘基因Cry1、Per1、Bmal1、Bmal2、Npas2啟動子CpG區域甲基化頻率與青年小鼠相比有顯著性差異，這種差異存在明顯的組織特異性，提示時鐘基因啟動子甲基化對生物鐘的調節在衰老小鼠不同組織中的作用可能不同。時鐘基因Cry1、Per1、Bmal1/2、Npas2啟動子區域甲基化與衰老相關，可能作為抗衰老藥物研究的新靶點。

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Tissue-specific Changes of Clock DNAPromoter Methylation withAging

ZHU Yan-qiu1a,LU Lu1a,LI Lin1a,CAI Yan-ning1b,ZHANG Lan1a
1.a.Department of Pharmacology,b.Department of Neurobiology,Xuanwu Hospital,Capital Medical University, Beijing 100053,China

Objective To investigate the role of the clock gene promoter methylation in aging.Methods C57BL mice of 4-(young,n=9) and 20-(old,n=10)month-old were determined the promoter methylation level of clock genes(Per1/2,Bmal1/2,Cry1/2,Clock,Npas2)in the stomach,spleen,vascular,kidney and striatum with methylation-specific polymerase chain reaction(MSP).Results The incidence of promoter methylation of Cry1,Bmal2 and Npas2 in spleen increased in old mice(P＜0.05),while the promoter methylation of Per1 in stomach decreased(P＜0.05),and the promoter methylation of Bmal1 in vascular increased(P＜0.05).Conclusion Promoter methylation of some clock genes is involved in process of aging in a tissue-specific way.

aging;circadian rhythm;clock genes;promoter methylation

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.005

R339.3

A

1006-9771(2015)05-0514-05

2015-02-27

2015-04-07)

1.國家自然科學基金項目(No.81473373)；2.北京市自然科學基金項目(No.7132110)；3.北京市中醫管理局重點項目(No. KJTS2011-04)；4.北京市新世紀百千萬人才工程項目(No.008-0014)；5.首都衛生發展科研專項項目(No.首發2011-1001-05)；6.北京市教委新醫藥學科群項目(No.XK100270569)。

1.首都醫科大學宣武醫院，a.藥物研究室；b.神經生物室，北京市100053。作者簡介：祝艷秋(1990-)，女，漢族，江蘇泰州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經藥理學，抗衰老藥理學。通訊作者：張蘭(1972-)，女，北京市人，博士，教授，研究員，碩士研究生導師，主要研究方向：神經藥理學、中藥藥理學、抗衰老藥理學。E-mail:lanizhg@hotmail.com。