痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構型①

王玉昌，龐偉，馮歡歡，劉師振，張慧

痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構型①

王玉昌1，龐偉1，馮歡歡1，劉師振2，張慧3

目的探討骨骼肌在痙攣狀態下對DNA甲基化水平的影響及與肌纖維構型的相關性。方法健康5日齡Wistar新生仔鼠100只，隨機分為模型組和對照組。前者制備痙攣型癱瘓大鼠模型成功后飼養30 d。對兩組大鼠腓腸肌進行肌肉活檢。分別進行骨骼肌DNA甲基化水平測定、骨骼?、裥图∏虻鞍字劓渕RNA半定量RT-PCR檢測，透射電鏡觀察。結果模型組骨骼肌總體DNA甲基化水平(4.95±0.83)×10%，顯著低于對照組的(6.59±0.75)×10%(P＜0.001)；模型組骨骼肌Ⅰ型肌球蛋白重鏈mRNA表達量(1.23±0.31)，顯著高于對照組的(0.44±0.29)(P＜0.001)。電鏡觀察，模型組骨骼肌Z線排列不規整，兩旁骨骼肌線粒體增多，線粒體腫脹，線粒體嵴部分斷裂；粗細肌絲數量關系失衡，肌原纖維包膜融合，有的包膜間隙增寬。結論痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA低甲基化，Ⅰ型肌球蛋白重鏈mRNA高表達；電鏡檢測以Ⅰ型纖維表現為主。沒有充足證據表明骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構型改變相關。

痙攣型癱瘓；甲基化；超微結構；Ⅰ型肌球蛋白重鏈

[本文著錄格式]王玉昌，龐偉，馮歡歡，等.痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構型[J].中國康復理論與實踐, 2015,21(5):519-523.

CITED AS:Wang YC,Pang W,Feng HH,et al.DNA methylation and muscle fiber configuration on skeletal muscle in spastic paralysis rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):519-523.

痙攣型癱瘓是腦性癱瘓中發病率最高的一種類型，預后相對較好，發病率約占腦癱的60%～70%[1]。康復過程中，肢體功能恢復時程較長，肌力增加幅度較慢。究其原因，除了上運動神經元損傷外，骨骼肌特性的改變也會起重要作用。近年來，國外學者開展相關的組織化學研究，揭示痙攣型骨骼肌纖維組成以Ⅰ型纖維為主[2]；對于痙攣肌肉形態改變的分子機制缺乏報道[3-4]。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學修飾之一[5]，能在不影響基因結構的基礎上，調控基因的表達，從而影響組織的表型。本研究探討痙攣狀態對

肌肉DNA甲基化水平及肌纖維超亞微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級5日齡Wistar大鼠100只，體重(21.10± 1.25)g，由吉林長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物許可證號SCXK(吉)-2011-0004。室溫21～26℃、相對濕度43%～45%環境下飼養。

大鼠按體重編號，運用隨機數字表，抽出50個數字為模型組，其他為對照組。

1.2 器材與藥品

戊二醛：FLUKA CHEMIKA。RNA提取試劑盒：北京鼎國生物工程公司。ABI Prism 7000型定量PCR：美國應用生物系統公司。HITACHI H-7650型透射電子顯微鏡：SONY。生理鹽水：哈爾濱三聯藥業有限公司，批號130131A52。水合氯醛：天津市百世化工有限公司，批號20140513，用生理鹽水配制成10%溶液。

1.3 方法

1.3.1 模型制備

模型組采用兩血管阻斷法[6]及雙側頸總動脈結扎法制作痙攣型癱瘓模型。對照組只行頸總動脈剝離、探查術。

1.3.2 模型檢測

模型制備過程中死亡10只，術后24 h死亡6只；對照組麻醉過程中死亡4只。連續觀察48 h，模型組存活34只，對照組存活46只。術后30 d，模型組采用懸吊試驗和改良Ashworth評定表進行評定，大鼠下肢穩定性差，四肢很少有隨意活動，跛行，下肢肌張力1級以上視為合格。

大鼠30日齡后，其行為、肌張力已與成年大鼠沒有明顯差異，神經行為學特征性表現能充分展示，相當于人類痙攣型癱瘓典型臨床癥狀表現階段[7]。

術后30 d，取模型組和對照組腓腸肌活檢。分為3份。

1.3.3 DNA甲基化水平檢測

腓腸肌組織用Agilent LC 1100型高效液相色譜儀進行總甲基化檢測。

總甲基化水平=5 mC的峰面積/(c的峰面積+5 mC的峰面積)×100%

1.3.4 RT-PCR檢測

腓腸肌組織行RNA提純及DNase檢測。采用Thermoscript PT-PCR系統和ABI.PRISM7000sequence導向系統進行mRNA的RT-PCR的熱循環。參照大鼠骨骼?、裥图∏虻鞍字劓?myosin heavy chain-I, MHC-Ⅰ)合成引物：

按照標準擴增30次。

原始數據轉換采用standard dilutions Linkeg軟件進行數據轉換。

1.3.5 透射電鏡觀察

腓腸肌組織修成1×1×1 mm，2.5%戊二醛固定，隨機編號，送兩個電鏡實驗室觀察。1%四氧化鋨二次固定，乙醇逐級脫水，4號膠囊包埋，醋酸鈾和檸檬酸鉛依次染色，H-7650型透射電子顯微鏡觀察。

1.4 統計學分析

對總體甲基化水平數據由十位數轉換為個位數。數據用SPSS 17.0統計軟件進行處理。甲基化水平與半定量RT-PCR數據用(ˉ±s)表示，采用獨立樣本t檢驗。甲基化水平與MHC-ⅠmRNA表達量進行Pearson相關性分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA表達量

模型組骨骼肌DNA甲基化水平顯著低于對照組(P＜0.001)，MHC-ⅠmRNA顯著高于對照組(P＜0.001)。見表1。

表1 兩組骨骼肌DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA的比較

模型組骨骼肌DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA表達量呈弱負相關(r=-0.09,P＜0.001)，對照組DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA表達量呈弱負相關(r=-1.18,P=0.01)。

2.2 電鏡觀察

骨骼肌纖維縱切面上，對照組肌原纖維由上千條粗、細兩種肌絲有規律地平行排列組成，Z線完整，線粒體規律排列在Z線兩旁，明、暗帶規律排列。橫切面可見粗細肌絲呈點狀規律分布，一條粗肌絲周圍有6條細肌絲；一條細肌絲周圍有3條粗肌絲(圖1)。

模型組可見線粒體排列在Z線之間數量多，線粒體結構不完整，且集合分布于肌膜下；可見脂滴、肌漿膜間隙增寬、肌漿膜模糊不清。對線粒體放大后可

見其大小不一，部分腫脹，部分萎縮，嵴部分斷裂；線粒體排列不規律，胞漿基質疏松變淡，明暗帶模糊不清，Z線部分斷裂，線粒體排列不規律，局部放大可見Z線水紋狀，模糊不清，部分斷裂等。橫切面上，粗細肌絲不規律排列，可見部分融合現象，可見粗肌絲周圍繞7～8個細肌絲，另有粗肌絲周圍圍繞5個清晰的細肌絲(圖1)。

圖1 大鼠腓腸肌透射電鏡觀察

3 討論

骨骼肌纖維根據收縮特性和能量來源分為Ⅰ型和Ⅱ型(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx)。Ⅰ型肌纖維肌球蛋白ATP酶活性低，收縮速度相對較慢，但大量的線粒體使其具有強氧化活動的能力，因此可以持續低強度收縮；由于肌紅蛋白含量高，故呈紅色，又稱紅肌纖維，屬于慢收縮氧化性。Ⅱa型屬于快收縮氧化酵解型，Ⅱb型屬于快收縮酵解型，Ⅱx型是較少的未分化纖維，可見于妊娠30周之前[8-9]。

有研究顯示，痙攣肌肌纖維構型以Ⅰ型纖維占優勢[10-11]。這一組型有利于痙攣肌肉維持持續、耐疲勞、高張的肌張力狀態。

骨骼肌非正常收縮將導致其內DNA甲基化水平的變化[12]。甲基化是最常見的DNA修飾之一[13]。DNA甲基化是轉錄活性的主要調節者，環境因素會影響甲基化水平，這可能與一些神經系統疾病，如阿爾茨海默病有關。DNA甲基化水平對大腦各功能區的分布發揮著至關重要的作用[14-15]。

高張狀態下，骨骼肌可能進行表觀遺傳修飾，即DNA甲基化水平的改變；異常的甲基化水平反過來又加重痙攣肌肉的功能障礙。

本研究顯示，痙攣骨骼肌的甲基化水平低于正常肌肉；MHC-ⅠmRNA高表達。MHC-Ⅰ是肌球蛋白重鏈異形體之一，也是骨骼肌Ⅰ型纖維的重要組成部分，構成Ⅰ型纖維特性的結構基礎。MHC異形體是骨骼肌纖維類型的標志性蛋白，而MHC異形體蛋白合成主要是受轉錄水平調控[16]。MHC-ⅠmRNA高表達表明痙攣骨骼肌以Ⅰ型纖維為主，與組織化學水平所觀察到的表現一致。Mikeska等認為，DNA甲基化對相關基因的表達起抑制作用[17]。本研究支持這一觀點。

國外研究表明，環境因素可以影響呼吸鏈的電子正常傳遞，從而影響骨骼肌線粒體能量的產生，線粒體DNA編碼的蛋白質翻譯缺陷會導致呼吸鏈中氧化磷酸化的過程紊亂，從而引起骨骼肌能量代謝失衡[18-19]。本研究電鏡觀察顯示，病變以線粒體和粗細肌絲改變為主，這可能與痙攣型骨骼肌維持高張狀態所需能量有關。Sakellariou等研究表明，正常的骨骼肌粗細肌絲排列規整，如一條粗肌絲周圍有6條細肌絲，而一條細肌絲周圍有3條粗肌絲[20-21]。

雖然本研究中痙攣型骨骼肌低甲基化水平與MHC-ⅠmRNA高表達量呈負相關，但不足以說明它與肌纖維構型的相關性。本研究采用總甲基化水平代表肌球蛋白相關位點的甲基化水平，并不精確；MHC的異形體眾多，本研究只觀察MHC-Ⅰ，并不確定其他異形體的表達情況。此外，本研究只是初步探討了痙攣狀態對骨骼肌的超亞微結構。如何選取合適的肌球蛋白相關位點以及肌球蛋白重鏈異形體，是以后的研究方向。

痙攣型骨骼肌近似一種老齡化狀態，其肌肉大小、收縮特性等有別于同齡骨骼肌[22]。骨骼肌的痙攣狀態阻礙功能的發揮，給康復帶來負面影響，尤其是對肌張力協調性要求比較高的精細運動功能，這極大地影響了患者生活質量[23-25]。我們在進行抗痙攣康復治療的同時，如能更好地把握骨骼肌超亞微結構的變化，能更好指導康復計劃的實施及康復效果的預測。

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DNAMethylation and Muscle Fiber Configuration on Skeletal Muscle in Spastic Paralysis Rats

WANG Yu-chang1,PANG Wei1,FENG Huan-huan1,LIU Shi-zhen2,ZHANG Hui3
1.Rehabilitation Medical Research Institute of Jiamusi University,Jiamusi,Heilongjiang 154002,China;2.Shandong Jining No.1 People's Hospital,Jining,Shandong 272000,China;3.Yanzhou Tielu Hospital,Jining,Shandong 272100,China

Objective To investigate the DNA methylation of skeletal muscle in spastic paralysis rats and correlation with the muscle fiber configuration.Methods 100 5-day old Wistar rats were randomly divided into model group and control group.The former was established the spastic paralysis modle and reared for 30 days.Then,tissues from the gastrocnemius of all the rats were observed with triplicate DNA methylation,myosin heavy chain-I(MHC-I)mRNA with RT-PCR and transmission electron microscopy.Results The DNA methylation was(4.95±0.83)×10%in the model group,significantly less than(6.59±0.75)×10%in the control group(P＜0.001);while the MHC-I mRNA was(1.23±0.31),significantly more than(0.44±0.29)in the control group(P＜0.001).The Z-line was disordered,and the mitochondria near the Z-line increased,with edema and partially broken in cristae.The balance between the thick and thin filaments was broken,and myofibrils envelope fused.Conclusion Hypomethylation and hyperexpression of MHC-I mRNA have been found in skeletal muscle of spastic paralysis rats,which may result in type I fibers increase.However,there was no sufficient evidence to support the correlation between the DNAmethylation and the secondary pathological changes.

spastic paralysis;methylation;ultrastructure;myosin heavy chain-I

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.006

R742.3

A

1006-9771(2015)05-0519-05

2015-01-05

2015-03-02)

1.黑龍江省研究生創新科研項目(No.LM2014-049)；2.佳木斯大學校級科技創新團隊項目(No.Cxtd-2013-02)。

1.佳木斯大學康復醫學院暨黑龍江省小兒腦癱防治療育中心，佳木斯大學兒童神經康復實驗室，黑龍江佳木斯市154002；2.濟寧市第一人民醫院，山東濟寧市272000；3.濟寧市兗州區鐵路醫院，山東濟寧市272100。作者簡介：王玉昌(1987-)，男，漢族，山東曹縣人，碩士研究生，主要研究方向：小兒腦損傷的發病機制和防治研究。通訊作者：龐偉，男，副教授、副主任醫師。E-mail:pangwei76@aliyun.com。