幾種氧載體對納他霉素發酵的影響

王 爽，周 巍,2，劉紅冉，李永波，馬超峰，張 巖,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；2.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

幾種氧載體對納他霉素發酵的影響

王 爽1，周 巍1,2，劉紅冉1，李永波1，馬超峰1，張 巖1,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；2.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

為有效改善納他霉素發酵液中的氧傳遞速率，研究了幾種氧載體對納他霉素發酵的影響。結果表明，氧載體不能作為碳源被細胞利用，并能提高發酵體系溶氧量和傳氧速率，有效促進單位細胞的納他霉素產率的提高。在搖瓶發酵初期添加6%的大豆油、6%的橄欖油和9%的二甲基硅油，納他霉素產量分別提高了56.8%、59.5%和72.5%。發酵初期添加6%的表面活性劑吐溫-80可促進菌體生長，同時有效提高納他霉素產量82.6%。

褐黃孢鏈霉菌；納他霉素；氧載體；表面活性劑

納他霉素（Natamycin），又稱游鏈霉素，是一種天然的二十六元多烯大環內酯類抗生素，由褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus）等產生，能夠有效抑制酵母菌等真菌的生長及真菌毒素的產生。目前，我國允許使用的生物防腐劑僅為乳酸鏈球菌素（Nisin）、納他霉素（Natamycin）[1]。納他霉素在食品中的使用劑量低，很難被人體消化道吸收，對人體無致癌、致畸、致突變和致敏作用。同時納他霉素溶解度很低，既不會影響食品中的其他成分，也不會影響食品風味，其作為一種天然、廣譜、高效、安全的食品防腐劑，已在世界30多個國家廣泛應用于乳制品、肉制品、發酵酒、飲料和果汁等食品的生產和保藏[2-3]。

目前納他霉素在國際市場上需求數量巨大，產品出口空間廣闊。但國內發酵水平較低，導致生產成本太高，納他霉素的價格高達每千克上千元，這嚴重制約了納他霉素在食品工業的廣泛應用。因此許多研究機構開展了包括優化發酵培養菌株[4]、發酵培養基[5]、發酵培養條件[6]、添加前體物質[7-8]等優化方案的課題研究，以期降低納他霉素的生產成本，提高納他霉素的產量。

在發酵過程中，發酵液中的溶氧濃度（dissolved oxygen，DO）可以直接影響微生物的酶活性、代謝途徑，對微生物的生長和產物合成具有重要的影響。在常規的液態發酵體系中加入氧載體（oxygen vectors），其一般具有比水更高的溶氧量，且與發酵液不互溶，可以減少氣-液兩相之間的傳氧阻力，提高底物溶氧能力[9]。添加氧載體的發酵體系具有氧傳遞速度快、能耗低、氣泡生成少、剪切力小等特點[10]。近年來研究發現常用的氧載體有烷烴類化合物、氟碳化合物、煤油、植物油和表面活性劑等。液態烷烴類及煤油儲存使用過程中易引發一定的安全隱患，全氟化碳的高價格也抑制了其工業化的大量應用。因此研究植物油脂和表現活性劑對納他霉素生物合成的影響具有重要的理論和實用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

實驗菌株：褐黃孢鏈霉菌（S t re p t o m y c e s gilvosporeus）ATCC 13326，購于美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

斜面保存/平板分離培養基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、麥芽浸粉3 g/L、瓊脂粉15 g/L、蒸餾水1 L，pH 7.0。

種子培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨6 g/L、酵母粉6 g/L、NaCl 10 g/L、蒸餾水1 L，pH 7.0。

發酵培養基（YEME，酵母膏-麥芽膏培養基）：葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、麥芽浸粉3 g/L、MgCl2?6H2O 1.05 g/L、蒸餾水1 L，pH 7.0。

酵母粉、蛋白胨、麥芽浸粉、瓊脂、葡萄糖均為生化試劑；氫氧化鈉、氯化鈉、無水甲醇、二甲基硅油、橄欖油、吐溫-80均為分析純；大豆油（食用級）；納他霉素標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

BS-124S型電子天平 北京賽馬利斯公司；ES2315高壓蒸汽滅菌器 日本Tomy公司；HWY 22112型恒溫培養搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；DH-101-2型電熱鼓風干熱箱 天津市中環試驗公司；UV22550雙光束紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養方法

將1 環試管斜面菌種接入50 mL種子培養基中，28 ℃、180 r/min搖床培養48 h；然后取1 mL種子液加入50 mL發酵培養基中，于28 ℃、180 r/min搖床培養96 h。

1.3.2 樣品處理

取1.0 mL發酵液于離心管中，加入9.0 mL無水甲醇，振蕩器充分振蕩后4 000 r/min離心15 min，除去菌絲體及培養基中的雜質，所得上清液再用無水甲醇適當稀釋后即為待測液。

1.3.3 菌體生物量的測定

發酵液培養96 h后，用移液管吸取40 mL經過漏斗過濾，收集菌體，用去離子水洗滌3 次，濾紙105 ℃烘干24 h至質量恒定，以空白濾紙質量為對照，稱量并計算菌體生物量，重復測定3 次，取平均值。

1.3.4 紫外分光光度法測定納他霉素產量

配制一定質量濃度梯度的納他霉素標準溶液，用UV-2550雙光束紫外-可見分光光度計測定其在303.0 nm波長處的吸光度。以納他霉素標準溶液質量濃度x為橫坐標，303.0 nm波長處的吸光度y為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：y=0.115x—0.016（R2 = 0.999）。回歸方程線性關系明顯，說明納他霉素質量濃度在0.2～30.0 μg/mL范圍內與303 nm波長處的吸光度線性關系良好。測定按照1.3.2節得到的待測液在303 nm波長處的吸光度，代入標準曲線，計算得到待測液中納他霉素的含量。以未添加氧載體的發酵液中納他霉素含量為基準，計算添加氧載體的發酵液中納他霉素的產量，重復測定3 次，取平均值。

1.3.5 氧載體添加實驗

1.3.5.1 褐黃孢鏈霉菌對氧載體的可利用性

種子培養液離心，無菌水沖洗3 次，收集不含培養基成分的菌體，加入無菌水配成一定濃度的菌懸液。二甲基硅油、橄欖油、豆油及吐溫-80高溫滅菌將制備的菌懸液以10%的接種量接入無碳源培養基（對照組）以及添加3%氧載體的培養基（實驗組），搖床發酵培養。取等體積對照組和實驗組培養液比較菌體生物量。

1.3.5.2 氧載體添加量影響實驗

二甲基硅油、橄欖油、大豆油及吐溫-80高溫滅菌。在發酵初始階段按0%、3%、6%、9%、12%的添加量添加在裝液量50 mL/250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min進行發酵培養96 h。測定菌體生物量和納他霉素產量。

1.3.5.3 氧載體添加時間影響實驗

二甲基硅油、橄欖油、大豆油及吐溫-80高溫滅菌。按各氧載體的最優添加體積分數，分別在發酵后0、24、48、72 h時添加在裝液量50 mL/250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min進行發酵培養96 h。測定菌體生物量和納他霉素產量。得率系數計算公式同1.3.5.2節。

1.4 統計分析

所有數據結果采用SPSS統計軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）和鄧肯氏多重檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 褐黃孢鏈霉菌對氧載體的可利用性

有機試劑作為氧載體用于微生物好氧發酵的前提是不能作為碳源被細菌利用，考察褐黃孢鏈霉菌對液態烷烴的可利用性，以確定添加的氧載體能否作為碳源供細胞生長[11]。由圖1可知，對照組和實驗組菌體生物量基本相等（P＜0.05），說明實驗所用褐黃孢鏈霉菌不以其作為碳源生長繁殖[11]，因此添加物質可以作為氧載體用于納他霉素發酵。

圖1 氧載體對菌體生長的影響Fig.1 Effect of oxygen vectors on the growth of Streptomyces gilvosporeus

2.2 氧載體添加量的影響

2.2.1 大豆油添加量的影響

圖2 大豆油添加量對菌體生物量和納他霉素合成的影響Fig.2 Effect of soybean oil concentration on cell dry weight and natamycin production

由圖2a可知，在0%～15%的添加量范圍內，隨著大豆油的添加量的增加，菌體生物量顯著增加（P＜0.05），在添加量為15%時達到最大值26.5 g/L。發酵體系中加入大豆油時納他霉素產量比未加入時高，其中添加6%的大豆油可使納他霉素產量達到最高值580 mg/L，比對照組提高了56.8%。梁新樂等[12]報道，添加大豆油0.5%～5.0%，蝦青素產量隨大豆油添加量逐步提高，最高時達到2.98 mg/L。

由圖2b可知，不同大豆油添加量對納他霉素得率系數有顯著影響（P＜0.05），呈先增加后減小的變化趨勢，當大豆油添加量為6%時，納他霉素得率系數達到最大值，為38.67 mg/g。這說明產量的提高是單位質量細胞的納他霉素合成效率提高的結果，與梁新樂等[12]的研究報道一致。當添加9%、12%和15%的大豆油時，促進了菌體細胞的生長，但一定程度上抑制了產物的合成，因此得率系數顯著下降。這是因為過量加入大豆油搖瓶中存在較大油滴，易浮于表面，導致發酵液水分流失，表觀黏度增大引起氧氣傳質系數下降；而添加量為0～6%豆油的搖瓶中分散乳化效果較好，從而更有利于油-水兩相間的接觸與物質傳遞。

2.2.2 橄欖油添加量的影響

圖3 橄欖油添加量對菌體生物量和納他霉素合成的影響Fig.3 Effect of Olive oil concentration on cell dry weight and natamycin production

由圖3a可知，與大豆油添加效果類似，納他霉素產量隨橄欖油添加量的增加呈現先增加后減小的趨勢，在添加量為6%時達到最大值590 mg/L，比對照組提高59.5%，之后產量顯著降低（P＜0.05），當添加量為15%時，產量為345 mg/L，低于對照組，這說明高濃度的油脂不利于納他霉素的合成。與對照組相比，橄欖油添加量為12%時，菌體生物量由初始的12.5 g/L增加到14.3 g/L，影響并不明顯，當添加量為15%時油，菌體生物量顯著降低（P＜0.05），說明高添加量的橄欖油抑制菌體的生長。

由圖3b可知，納他霉素得率系數的變化趨勢與產物含量的變化趨勢基本一致，先升高后降低，并在添加量為6%時達到最高值44.36 mg/L。以上結果表明，添加適量橄欖油強化傳氧作用的最直接后果就是納他霉素的合成得到加強，而對細胞的生長（菌體生物量）影響不顯著，即單位細胞的納他霉素合成能力得到加強，單位產率提高。

2.2.3 二甲基硅油添加量的影響

由圖4a可知，隨著二甲基硅油添加量的增加，菌體生物量和納他霉素產量的影響均呈現先增加后減小的變化趨勢，且分別在添加量為6%和9%時達到最大值，納他霉素產量比對照組提高了72.5%，促進效果明顯（P＜0.05）。隨著添加量繼續增加，促進作用減弱，可能是由于表觀黏度的不斷增加影響了氧傳質系數[13]。

由圖4b可知，二甲基硅油低添加量的處理下得率系數較低，隨著添加量的升高，得率系數逐漸升高。這可能是因為抗生素的發酵過程分為即菌體生長階段和代謝物生產階段。在生長階段，菌體生長速率高，但產物合成速率較低；隨著菌體生長速率的減緩，產物進入大量合成生長階段。

圖4 二甲基硅油添加量對菌體生物量和納他霉素合成的影響Fig.4 Effect of polydimethyl iloxane concentration on cell dry weight and natamycin production

2.2.4 吐溫-80添加量的影響

圖5 吐溫-80添加量對菌體生物量和納他霉素合成的影響Fig.5 Effect of Tween-80 concentration on dry weight of cells and the yield of natamycin

由圖5a可知，與對照組相比，吐溫-80添加量對菌體生物量和納他霉素產量的影響均呈現增加趨勢，分別在添加量為15%和6%時分別達到最大值，分別為13.20 g/L和210 mg/L，納他霉素產量對照組提高了82.6%，促進效果明顯（P＜0.05）。當吐溫-80的添加量超過6%后，納他霉素的生成量略有減弱，但仍高于對照組。吐溫-80本質是一種油酸酯，具有乳化性質。目前表面活性劑對發酵產生的促進作用原理尚不很清楚，一般認為其作用在于改善細胞的通透性，增大細胞膜的通透能力，增加胞內胞外的物質平衡，改善通氣效果[15]。同時，吐溫-80又可以增加溶氧量、促進傳氧速率，改變發酵液流體特性，有利于提高納他霉素的產量。

由圖5b可知，那他霉素得率系數呈現出隨著吐溫-80添加量的升高不斷下降的趨勢，這與其他結果相異。這是因為吐溫-80對菌體生長和代謝產物的合成均呈現促進作用。低吐溫-80添加量對納他霉素的促進作用較強，添加較高添加量的吐溫-80更有利于菌體的生長，這與朱艷等[15]的研究結果一致。

2.3 氧載體添加時間的影響

2.3.1 氧載體添加時間對菌體生長和納他霉素產量的影響

圖6 氧載體添加時間對菌體生物量和納他霉素合成的影響Fig.6 Effect of oxygen vector addition time on cell dry weight and natamycin production

在氧載體添加量單因素試驗的基礎上，選取不同氧載體的最適添加量，分別研究其在發酵后0、24、48、72 h添加對褐黃孢鏈霉菌生長和納他霉素合成的影響。結果如圖6所示，添加4 種物質的作用趨勢一致，即隨著發酵后添加時間的延長，菌體生物量和納他霉素的生物合成量整體呈現下降趨勢，即最適的添加條件為發酵初期。這可能是因為在搖瓶培養時，由于褐黃孢鏈霉菌的耗氧速率很快，接種后數小時內培養液中的溶氧量降低，成為培養的限制因素。接種同時添加氧載體比指數生長期添加效果要明顯（P＜0.05），就是因為較早加入的氧載體，可以及時緩解培養過程中很快就會出現的氧不足問題[13]。

2.3.2 氧載體添加時間對納他霉素得率系數的影響

圖7 氧載體添加時間對納他霉素得率系數的影響Fig.7 Effect of Effect of oxygen vector addition time on the yield coefficient of natamycin

由圖7可知，單位細胞納他霉素產量逐漸降低（P＜0.05），最大值為在發酵初始添加氧載體。這是因為氧載體添加時間的不同對菌體生長影響比對納他霉素合成的影響小，這進一步驗證添加氧載體并不是由細胞總生物量提高所導致的，而是單位細胞的納他霉素產率增大的結果。隨著添加時間的延長，得率系數逐漸降低。推測可能是因為發酵初期體系溶氧較充足，同時前期生成的產物具有表面活性劑性質，可生成大量小氣泡，強化了氣-液界面的擴散，能一定程度上提高氧傳遞速率。隨著發酵的進行，體系中的納他霉素產量不斷增加，黏度增大，同時小氣泡能相互接合，氣-液比表面積降低，氧傳遞系數減小，出現溶氧不足問題。氧載體添加時間較晚，無法及時解決體系的溶氧限制問題，干擾了納他霉素的生物合成，單位細胞納他霉素產量也大量減少。

3 討 論

發酵過程中，氧的傳質速率主要受發酵液中溶解氧的濃度和傳遞阻力影響。而溶解氧對發酵的影響分為兩方面：一方面溶氧濃度影響與呼吸鏈有關的能量代謝，從而影響微生物生長；另一方面氧直接參與代謝產物的合成[16]。因此研究溶氧對發酵的影響及控制對提高生產效率，改善產品質量等都有重要意義[17]。

雙液相發酵（two-liquid phase fermentation）是在常規液態發酵體系中加入一種與水不相溶的油相，以提高底物或溶解氧的供給能力或解除產物的抑制作用[9]。按其目的不同分為三類：1）傳統的石油發酵，其目的是為了獲得菌體、菌體代謝產物和生物轉化產物；2）氧載體（oxygen vectors）發酵體系，以強化發酵體系中的氧傳遞過程；3）在上述兩類液相發酵體系中引入固體載體（或乳化劑），利用這種載體增加雙液相間的接觸面積，從而提高傳質速率和發酵產率[18]。微生物只能利用溶解于水中的氧而不能利用氣態的氧。而氧的溶解實質上是氣體吸收過程，是由氣相向液相傳遞的過程[19]。有學者[20-21]認為像植物油脂、油酸等具有正鋪展系數的氧載體加入到水中后，通過攪拌、超聲波等作用被分散乳化。由于油-水的相互排斥，氧載體最終將集中在氣液界面上，形成覆蓋氣泡的油膜，氧載體相對氧氣來說具有較強的溶解度，使得氧穿過水邊界層的滲透力增強，從而有利于氧的傳遞。孟娜等[22]研究表明，添加豆油、表面活性劑等氧載體后，可以提高統一發酵系統的氧傳遞系數值30%～300%，這與本研究的結果一致。

4 結 論

本實驗結果表明，添加種類、添加量和時間不同，對發酵體系的菌體生長和產物合成影響作用不同。大豆油、橄欖油、二甲基硅油及吐溫-80在發酵體系中不能作為碳源被利用。在發酵初期分別添加6%大豆油、6%橄欖油、9%二甲基硅油和6%的吐溫-80，納他霉素產量分別提高了56.8%、59.5%、72.5%和82.6%。其中二甲基硅油和吐溫-80作為乳化劑和活性劑，其在發酵體系中的促進效果較好，且價格低廉，能有效促進單位細胞的納他霉素產率增大從而提高產量，為后期的發酵罐實驗提供一定理論基礎。

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Effects of Oxygen Vectors on Microbial Production of Natamycin

WANG Shuang1， ZHOU Wei1，2， LIU Hongran1， LI Yongbo1， MA Chaofeng1， ZHANG Yan1，*
(1. Hebei Food Safety Key Laboratory， Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050071， China; 2. College of Food Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding 071000， China)

In order to effectively improve the oxygen transfer rate in the microbial production of natamycin, the effect of several oxygen vectors on Streptomyces gilvosporeus biomass and natamycin production was studied. The results showed that oxygen vectors and surfactants could not be used as carbon source although they were useful to improve dissolved oxygen and transfer rate, as well as the production of natamysin. The yield of natamycin could be improved by 56.8%, 59.5% and 72.5% after adding 6% soybean oil, 6% olive oil and 9% polydimethyls iloxane at the beginning of fermentation, respectively. With the addition of 6% Tween-80, the yield of natamycin was improved by 82.6% and growth-promoting effect on the strain was observed.

Streptomyces gilvosporeus; natamycin; oxygen vector; surfactant

TQ465.92；Q939.13

A

1002-6630（2015）09-0102-06

10.7506/spkx1002-6630-201509019

2014-07-12

河北省質量技術監督局科技計劃項目（100107）

王爽（1989—），女，工程師，碩士，研究方向為農產品加工及貯藏工程。E-mail：wangshuang19890720@126.com

*通信作者：張巖（1979—），男，正高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：snowwinglv@126.com