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辣椒素對 糖尿病大鼠腸道健康的影響

2015-12-13 05:41:34程亞嬌王倩倩陸紅佳游玉明覃小麗
食品科學 2015年9期
關鍵詞:劑量糖尿病模型

程亞嬌,王倩倩,陸紅佳,游玉明,葉 敏,覃小麗,劉 雄

(西南大學食品科學學院,重慶 400715)

辣椒素對 糖尿病大鼠腸道健康的影響

程亞嬌,王倩倩,陸紅佳,游玉明,葉 敏,覃小麗,劉 雄*

(西南大學食品科學學院,重慶 400715)

目的:研究辣椒素對鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠腸道環境的影響。方法:將40 只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠按體質量隨機分為5 組,每組8 只。其中一組為正常對照組(CON組),其余4 組采用STZ誘導大鼠建立糖尿病模型,分別為模型空白組,辣椒素低(3.0 mg/(kg?d))、中(6.0 mg/(kg?d))、高(9.0 mg/(kg?d))劑量組。實驗期間給大鼠喂食基礎飼料,自由采食和飲水。飼養28 d后將大鼠處死解剖,測定各組大鼠體質量、盲腸壁表面積、盲腸內容物的水分含量、pH值、游離氨含量以及微生物數量、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)含量和腸道組織形態等指標。結果:辣椒素使糖尿病大鼠的總游離氨含量、pH值、水分含量均升高,SCFA含量降低,盲腸內容物中有益菌數量降低,有害菌數量顯著增加(P<0.05)。結論:灌胃低、中、高劑量的辣椒素對糖尿病大鼠腸道環境均有一定的損害作用。

辣椒素;糖尿病大鼠;腸道;微生物;短鏈脂肪酸;腸道組織形態

辣椒素(capsaicin)是一種含草酰胺的生物堿,其分子式為C18H27NO3,化學名稱為(反式)-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺,是辣椒中主要的辛辣成分。隨著當今營養科學的發展以及人們健康意識的增強,食用辣椒的利弊逐漸成為人們關注的一個焦點。國內外研究表明:辣椒素藥理作用廣泛,具有鎮痛止癢[1-2]、降血糖[3]、降血脂[4]、降膽固醇[5]等功效,同時具有防治心血管疾病[6]、呼吸道疾病[7]的作用,還可用于殺菌[8]、減肥[9]、治療風濕性關節炎[10]、銀屑病[11]、抗癌[12]、保護腸道[13]等。

糖尿病是由遺傳和環境因素共同作用而引起的,以血漿葡萄糖(血糖)水平升高為特征的全身性代謝疾病,是當前最常見的慢性疾病之一,主要表現為糖代謝紊亂,同時還伴有免疫力下降和各種慢性炎癥等。糖尿病患者碳水化合物和脂肪代謝紊亂,影響全身各器官組織的正常生理活動,可導致各種并發癥,如白內障、慢性腎衰竭、動脈粥樣硬化等疾病[14-15]。近年來研究發現[16],辣椒素能夠使胰島素分泌增加、促進脂肪細胞的分解和凋亡、降低血糖水平,從而對糖尿病發揮一定程度的緩解和治療作用。

許多重要疾病的發生都與腸道微生態有著緊密的關系,而腸道健康則通過腸道發酵產物、腸道形態以及腸道菌群活性等方面來體現。李明澤等[17]研究表明灌胃辣椒素對健康大鼠腸道發酵產物有不良的影響,且與灌胃劑量呈正相關;Prakash等[18]研究發現辣椒素可以刺激雄性Wistar大鼠腸絨毛增生,促進小腸對營養物質的吸收,對腸道健康起到積極的改善作用。王娜[19]研究了腸道菌群與Ⅱ型糖尿病患者的關系,發現糖尿病使患者腸道菌群紊亂,有益菌減少,有害菌增多。但辣椒素對糖尿病大鼠腸道健康的作用以及不同劑量辣椒素對腸道健康的影響尚未見有關報道。那么,辣椒素是否會影響糖尿病大鼠腸道的發酵產物、破壞腸道菌群平衡,進而影響腸道健康呢?對此,本實驗以糖尿病大鼠為模型,研究不同劑量的辣椒素對糖尿病大鼠腸道內環境以及腸道組織形態的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,4 周齡,體質量200~220 g,購自重慶滕鑫比爾實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(渝)2007-0008,實驗前每只大鼠的血糖值范圍在3.0~5.0 mmol/L之間,為正常血糖值;基礎飼料,購于重慶滕鑫比爾實驗動物有限公司。

金龍魚大豆油(食用級) 市售;天然辣椒素(辣椒堿含量為95.7%) 河南倍特生物科技有限公司。

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ) 美國Sigma公司;巴豆酸(色譜級標準品,純度>99.7%) 日本東京天成工業株式會社;無水乙醇、氫氧化鈉、次氯酸鈉、苯酚、鎢酸鈉、硫酸(分析純) 成都市科龍化工試劑廠;乙酸(色譜級) 英國Johnson Matthey公司;丙酸、丁酸、異丁酸(色譜級標準品,純度>99%)梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;亞硝基鐵氰化鈉(分析純) 天津市光復精細化工研究所;伊紅、蘇木精 碧云天生物技術研究所;SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;糞便細菌基因組DNA提取試劑盒 天根科技有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;其他均為實驗室常用分析純化學試劑。

1.2 儀器與設備

GC-2010高效氣相色譜儀 日本島津公司;PHS-3C精密pH計 上海大普儀器有限公司;722-P可見分光光度計 上海現科儀器有限公司;Nikon H550L高分辨率數碼照相機 日本尼康公司;EG1150H切片機 德國Leica公司;LightScanner32型PCR儀 美國Idaho公司;JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型的建立

造模方法[20]:SD大鼠經適應性飼養1 周后進行誘導,誘導前禁食12 h,腹腔按65 mg/kg(以體質量計,下同)注射STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中,pH 4.2),正常對照組注射等量的緩沖液。7 d后尾尖取血測定其空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG),以FBG值高于11.1 mmol/L且穩定2 d作為糖尿病大鼠造模成功的標準,用于后續實驗。

1.3.2 動物飼養

體質量為200~220 g的4 周齡SD大鼠8 只,作為正常對照組,另取32 只造模成功的糖尿病大鼠隨機分為4 組。室溫(25±1) ℃飼養,12 h明暗輪換(9:00—21:00),每天對正常對照組和模型空白組大鼠灌胃大豆油,辣椒素低、中、高劑量組分別灌胃含3、6、9 mg/mL辣椒素的大豆油溶液,灌胃劑量均為每0.1 mL/100 g。所有大鼠均飼喂基礎飼料(基礎飼料配方見表1),自由飲水和采食,每天記錄大鼠采食量,3 d稱量一次大鼠體質量。實驗周期為28 d,實驗期最后一天斷糧12 h,19:00—21:00乙醚麻醉后斷頭處死解剖,測定各組大鼠體質量、盲腸壁表面積、盲腸內容物水分含量、pH值、游離氨含量以及微生物數量、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)含量和腸道組織形態等指標。

表1 基礎飼料配方Table 1 Composition of the basal diet

1.3.3 檢測指標與方法

1.3.3.1 盲腸壁表面積測定

用生理鹽水洗凈大鼠盲腸,充分展開后固定劃有標準刻度(cm)的A4紙上,勾出其輪廓,待紙干燥后將盲腸壁輪廓復寫在厚的打印紙上,然后將紙上的盲腸輪廓圖剪下。用精密度為0.000 1 g的電子天平準確稱量輪廓圖紙質量(m2)和1 cm2的打印紙質量(m1),然后以公式(1)計算盲腸壁表面積[21]。

1.3.3.2 盲腸內容物質量的測定

以公式(2)計算盲腸內容物質量。

1.3.3.3 盲腸內容物水分含量測定

稱取一定質量的新鮮盲腸內容物(m1),放入預恒質量鋁盒中,105 ℃恒質量(m2),以公式(3)計算其水分含量。

1.3.3.4 盲腸內容物pH值測定

稱取一定質量的新鮮盲腸內容物于10 mL去離子水預處理離心管中,加入10 倍(V/m)去離子水,旋渦混合儀上混勻后靜置30 min,測定上清液pH值。

1.3.3.5 盲腸內容物游離氨含量測定

無氨水制備:在1 000 mL蒸餾水中加入0.10 mL硫酸(ρ=1.84 g/mL),并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾,棄去前50 mL蒸出液,然后將蒸出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。

稱取0.3 g左右的盲腸內容物,加入10 倍無氨水,將盲腸內容物樣品4 000 r/min離心5 min,吸取上清液1 mL,依次加入1 mL的0.5 mol/L苯酚溶液(含有0.001 mol/L亞硝基鐵氰化鈉)和1 mL的0.625 mol/L氫氧化鈉溶液(含有0.03 mol/L次氯酸鈉),60 ℃條件下保溫7 min,于625 nm波長處測定吸光度[22]。

1.3.3.6 盲腸內容物中SCFA含量測定

稱取0.5 g左右盲腸內容物放入超純水清洗過的10 mL離心管中,立即加入2 mL含有5 mmol/L巴豆酸的10 mmol/L氫氧化鈉溶液,充分混勻后4 ℃、4 000 r/min離心15 min,吸取上清液轉移至另一個10 mL的離心管中,10 000 r/min繼續離心15 min,吸取上清液1 mL,0.25 μm濾膜過濾,用于氣相色譜檢測。

氣相色譜條件[23]:進樣量1 μL;進樣口溫度220 ℃;柱流量0.95 mL/min;升溫程序:柱溫90℃,平衡0.5 min,然后以5 ℃/min升溫至150 ℃,保留時間7 min;檢測器溫度230 ℃;氫氣流量40 mL/min,空氣流量400 mL/min,尾吹流量40 mL/min。

1.3.3.7 盲腸內容物菌群數量測定

糞便樣品DNA的提取:按糞便基因組DNA提取試劑盒說明書方法提取。

SYBR?Green實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR):反應體系為 20 μL(SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL,上下游引物(表2)各0.8 μL,模板2 μL,蒸餾水6.4 μL。反應程序確定為:各細菌先經過95 ℃預變性1 min,之后95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共40 個循環。

表2 5 種細菌的PCR擴增引物序列Table 2 Primer sequences for PCR of five kinds of bacteria

1.3.3.8 小腸和結腸組織形態觀察

取材及固定→脫水→透明→包埋(軟蠟1:30 min;軟蠟2:30 min)→塑型和切片→展片和黏片→染色和封片→顯微鏡拍照

固定液為波恩試劑(均為體積分數):75%飽和苦味酸溶液、25%飽和甲醛溶液、5%的冰醋酸。

1.4 數據統計分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件對實驗數據進行統計分析,實驗數據以±s表示;各組結果進行單向方差分析,差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 辣椒素對糖尿病大鼠體質量及采食量的影響

表3 辣椒素對糖尿病大鼠體質量和飼料采食量的影響Table 3 Effects of different capsaicin doses on body weight and foodTable 3 Effects of intake in diabetic rats

由表3可知,與正常對照組相比,模型空白組大鼠的終體質量與采食量存在顯著差異(P<0.05),而辣椒素各劑量組與模型空白組無明顯差異,辣椒素各劑量組間也無顯著差異。糖尿病導致葡萄糖的氧化發生障礙,機體所需能量不足,患者感到饑餓需要進食大量的食物,故糖尿病大鼠的采食量顯著增加。由于糖尿病大鼠氧化供能發生障礙,需動用體內大量脂肪及蛋白質的氧化功能,因此身體消瘦、體質量減輕。辣椒素各劑量組與模型空白組相比,終體質量降低、采食量減少,可能是由于辣椒素影響了大鼠胃腸道的吸收功能,但辣椒素不同劑量組大鼠的體質量和采食量之間差異不顯著。

2.2 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸組織相關指標的影響

由表4可知,模型空白組與正常對照組相比,盲腸總質量、盲腸壁濕質量以及盲腸壁表面積均顯著增加(P<0.05),這與糖尿病大鼠的飲食量顯著增加有關;除辣椒素低劑量組盲腸壁濕質量高于模型空白組外,辣椒素中、高劑量組與模型空白組相比,盲腸總質量、盲腸壁濕質量和盲腸壁表面積均無顯著差異。

表4 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸總質量、盲腸壁濕質量和盲腸壁表面積的影響Table 4 Effects of different capsaicin doses on caecal weight, wet weight and area of the ceacal wall in diabetic rats

2.3 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸內容物相關指標的影響

配制5 mmol/L氯化銨溶液,并分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于4 mL比色皿中,用無氨水稀釋至1.0 mL,625 nm波長處測定其吸光度并繪制標準曲線得到回歸方程y=0.108 7x+0.008 3(R2=0.999 1)。

表5 辣椒素劑量對糖尿病大鼠盲腸內容物指標的影響Table 5 Effects of different capsaicin doses on caecal contents in diabetic rats rats

游離氨主要是小腸中谷氨酰胺代謝產生的[24],被認為是結腸內潛在的腫瘤促進因子。研究表明,腸道菌群嚴重失調(雙歧桿菌數量下降,大腸桿菌、梭菌大量繁殖),尿總堿合成受阻,會產生更多的氨[25]。由表5可知,模型空白組與正常對照組相比,盲腸內容物質量、游離氨含量、pH值均顯著增加(P<0.05),水分含量卻顯著性降低(P<0.05),說明糖尿病使大鼠腸道菌群紊亂,會產生更多的有害物質;辣椒素各劑量組與模型空白組相比,總游離氨含量、盲腸內容物質量、pH值以及水分含量呈上升趨勢,辣椒素中、低劑量組的pH值與模型空白組相比達到顯著水平,表明辣椒素能增加游離氨的含量,使腸道pH值升高,有利于有害菌的生長。在總游離氨含量升高、短鏈脂肪酸含量下降的綜合狀況影響下,盲腸內容物pH值升高,pH值的改變也影響腸道微生物的生長。

2.4 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸內容物中微生物數量的影響

實時熒光定量PCR測定大鼠盲腸內容物中微生物數量,經定量分析,以溫度為橫坐標,熒光強度為縱坐標,得到各菌群的溶解曲線。如圖1所示,各菌群產物目的基因特異性強,沒有非目的條帶和二聚體產生。

圖1 大鼠腸道微生物的PCR溶解曲線Fig.1 PCR melting curve of intestinal microorganisms in rats

表6 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸內容物中微生物數量的影響Table 6 Effects of different capsaicin doses on the microflora of cacal content in diabetic rats lg(CFU/g)

腸道菌群參與宿主體內糖類、脂肪、氨基酸等多種營養物質的代謝,對宿主的健康狀態具有顯著影響,因此腸道菌群與代謝疾病的發生發展密切相關。作為一種典型的代謝性疾病,糖尿病患者腸道菌群與健康人相比有顯著變化,此外高血糖可導致小腸等各種器官發生不同程度的氧化應激反應。Cani等[26]報道雙歧桿菌可以改善糖耐量水平、改善糖誘發胰島素的分泌狀況,降低內毒素血癥的發病率。由表6可知,模型空白組與正常對照組相比,大鼠盲腸內容物中雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌的數量顯著降低(P<0.05),而大腸桿菌和腸球菌數量顯著升高(P<0.05),厭氧菌數量也呈上升趨勢,說明糖尿病可引發腸道環境紊亂,有益菌減少、有害菌顯著增加(P<0.05);辣椒素各劑量組與模型空白組相比,雙歧桿菌數量呈下降趨勢,其中辣椒素中、高劑量組達到顯著水平,辣椒素低、中劑量組的腸球菌數量顯著增加,大腸桿菌、厭氧菌數量也呈現上升趨勢,說明辣椒素使腸道中的有益菌數量減少,有害菌數量增加,辣椒素對會加重糖尿病大鼠腸道損傷。

2.5 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量的影響

表7 辣椒素對糖尿病大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量的影響Table 7 Effect of different capsaicin doses on SCFA in the caecal contents of diabetic rats

生物體內的SCFA主要是由乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌在結腸內將不容易消化的糖經酵解而成,通過離子和非離子形式被結腸黏膜吸收,是結腸和小腸上皮細胞的主要供能物質[27]。近年來的研究發現,SCFA不僅是腸上皮細胞主要的能量來源,還有調節腸道菌群平衡、改善腸道功能、調節免疫力、抗腫瘤和調控基因表達等作用[28]。由表7可知,與正常對照組相比,模型空白組大鼠的盲腸內容物中丙酸、異丁酸、丁酸含量顯著降低(P<0.05),乙酸和總SCFA含量也存在下降的趨勢,但沒有達到顯著性水平,說明糖尿病使大鼠腸道菌群紊亂,可能存在著生成乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸的某些厭氧益生菌減少,從而引發代謝紊亂;辣椒素各劑量組與模型空白組相比,丙酸、丁酸和總SCFA含量差異不大。

2.6 辣椒素對糖尿病大鼠小腸和結腸組織形態的影響

2.6.1 辣椒素對糖尿病大鼠小腸組織形態的影響

圖2 光鏡下觀察各組大鼠小腸形態的變化Fig.2 Changes in small intestine morphology of diabetic rats

小腸是糖類、脂肪、蛋白質等營養物質消化吸收的重要器官,而小腸黏膜結構與功能的完整狀態是腸道正常發揮消化吸收作用的生理學基礎。絨毛長度、隱窩深度及黏膜厚度等是衡量小腸消化吸收功能的重要指標。由圖2可知,與正常對照組相比,模型空白組大鼠小腸的絨毛長度顯著增加且排列更加緊密,絨毛有部分破損,腸壁厚度降低,通透性增加,小腸上皮細胞肥大增生,排列緊密,可能與糖尿病導致消化能力增強但吸收功能減弱有關;辣椒素各劑量組與模型空白組相比,絨毛長度變短,小腸黏膜的完整性受到破壞,隱窩深度加深,小腸上皮細胞減少,說明一定劑量的辣椒素對腸道結構有一定損傷作用。

2.6.2 辣椒素對糖尿病大鼠結腸組織形態的影響

圖3 光鏡下觀察各組大鼠結腸形態的變化Fig.3 Change in colon morphology of rats examined by light microscope

結腸除具有傳輸和貯存食物殘渣及提供微生物菌群生長環境等功能外,還具有消化和吸收功能。由圖3可知,與正常對照組相比,模型空白組大鼠結腸壁厚薄不勻、橫截面積增大,絨毛排列緊密、長度變短,褶皺數增多,腸表面細胞異常增生并且排列緊密,肌層厚度顯著增加。辣椒素各劑量組與模型空白組相比,腸絨毛長度變短,隱窩深度加深,絨毛數目和褶皺數減少,辣椒素高劑量組絨毛部分受損,表明辣椒素對結腸組織有一定的破壞作用。

3 結 論

本實驗探討了辣椒素對糖尿病大鼠腸道健康的影響,結果顯示,辣椒素能抑制糖尿病大鼠腸道中雙歧桿菌的生長,降低SCFA的含量,降低盲腸質量和盲腸壁表面積;辣椒素能促進腸道中大腸桿菌和腸球菌等有害菌的生長,使腸道pH值上升。綜合pH值、游離氨含量、總SCFA含量、有害菌數量的變化及腸道組織形態可以看出辣椒素對糖尿病大鼠的腸道有一定損傷作用,本研究對于糖尿病患者的日常飲食指導具有一定參考價值,對其作用機理還有待進一步研究。

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Effect of Capsaicin on Intestinal Health in Diabetic Rats

CHENG Yajiao, WANG Qianqian, LU Hongjia, YOU Yuming, YE Min, QIN Xiaoli, LIU Xiong*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: The effect of capsaicin on intestinal health in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats was investigated. Methods: Totally 40 male SD rats were randomly divided into five groups including normal non-diabetic control group (CON) and f our diabetic model groups established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ). After successful model establishment, the diabetic rats were administered daily with capsaicin at doses of 0, 3, 6 and 9 mg/(kg?d) in soybean oil, respectively. All the rats were fed a basal diet, and feed intake was recorded daily. All of them were sacrificed after 28 days of feeding for the assessment of body weight, appendix area, caecum content, moisture conte nt, pH, free ammonia, microbe, short-chain fatty acid (SCFA) and intestinal tissue morphology. Results: Feeding capsaicin could result in a significant increase in free ammonia and harmful bacteria, and a reduction in pH, moisture content, SCFA levels and beneficial bacteria in caecum content (P < 0.05). Conclusion: Capsaicin can cause intestinal injury in diabetic rats.

capsaicin; diabetic rats; intestinal; microorganism; short-chain fatty acid; intestinal morphology

TS201.4

A

1002-6630(2015)09-0154-06

10.7506/spkx1002-6630-201509028

2014-06-08

國家自然科學基金面上項目(31071529)

程亞嬌(1989—),女,碩士研究生,研究方向為食品化學與營養學。E-mail:chengyajiao0902@163.com

*通信作者:劉雄(1970—),男,教授,博士,研究方向為碳水化合物功能與利用,食品營養學。E-mail:liuxiong848@hotmail.com

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