人工培育蟬花蟲草的抗腫瘤活性

陳安徽，邵 穎，李繼武，蔣昭志，陳宏偉

（1.徐州工程學院 江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221008；2.亳州千草藥業有限公司，安徽 亳州 236800）

人工培育蟬花蟲草的抗腫瘤活性

陳安徽1，邵 穎1，李繼武2，蔣昭志2，陳宏偉1

（1.徐州工程學院 江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221008；2.亳州千草藥業有限公司，安徽 亳州 236800）

以天然蟬花蟲草生藥為對照，以中國倉鼠卵巢腫瘤（Chinese hamster ovary，CHO）細胞株為模型，采用刃天青染色法檢測人工培育蟬花蟲草的抗腫瘤活性。結果表明：人工培育蟬花蟲草和天然蟬花蟲草生藥都具有抗腫瘤活性，且活性成分均為中等極性化合物。對人工培育蟬花蟲草中的抗腫瘤活性成分進行分離制備，得到兩種化合物，命名為化合物1和化合物2。化合物1經鑒定為蟲草素，化合物2經純度驗證為純品，活性驗證結果發現當其質量濃度為50 μg/mL時，對CHO細胞抑制率高達（94.55±2.33）%。

人工培育蟬花蟲草；抗腫瘤活性；CHO細胞；蟲草素

蟬花（Cordyceps cicadae）又名蟬茸、蟬草等，是蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）等真菌寄生于一些蟬若蟲后形成的菌蟲復合體，是我國傳統中藥材[1-4]。蟬花具有多種藥用價值，古代和現代醫書《證類本草》、《本草綱目》、《中華藥物大全》和《中華藥海》中就記載蟬花有主治小兒天吊、夜啼心悸、解痙、散風熱，治療麻疹、多淚、目赤等功效[5]，近代滬上名醫陳以平教授還最早使用蟬花代替冬蟲夏草治療慢性腎功能衰竭，并取得顯著成效[6]。但是近年來天然野生蟬花資源短缺，使得蟬花的人工培育及其人工培養物的功效價值受到了廣泛關注[7-11]。陳祝安等[12]于自然基物上對蟬擬青霉進行人工培養獲得了類似蟲體生的孢梗束，并發現人工培養物具有明顯的鎮痛、鎮靜、解熱等作用，毒理學實驗還表明人工培育蟬花還具有低毒的特性；徐紅娟等[13]對蟬擬青霉進行液體深層發酵，并從發酵菌絲體中分離得到具有抗真菌活性的多球殼菌素；蟬花人工培養菌絲體經系統翔實研究顯示其具有與天然蟬花相似的改善腎功能的功效[14-18]；許多學者對蟬擬青霉多糖進行了系統研究，佐證了其明顯提高機體免疫力[19-22]、調節脂類代謝[23]、促進造血、提升營養狀況[24]的作用；陳柏坤等[25]曾提出蟬擬青霉多糖可能具有直接抑制白血病細胞株U937、K562的能力，但至今未見有關蟬花人工培養孢梗束及培養基質抗腫瘤活性的研究。本研究以天然蟬花蟲草生藥為對照，以中國倉鼠卵巢腫瘤（Chinese hamster ovary，CHO）細胞株為模型，研究人工培育蟬花孢梗束及其培養基質的抗腫瘤活性，并對人工培育蟬花孢梗束中的抗腫瘤活性成分進行分離，以期為人工培育蟬花替代野生資源及人工培養物的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

天然蟬花蟲草采集自安徽省蕭縣皇藏峪風景區；無性型菌株保存于徐州工程學院食品學院實驗室。

液體種子培養基：馬鈴薯200 g（煮汁后4 層紗布過濾）、葡萄糖20 g、純水1 L，121 ℃滅菌20 min。

蟲草栽培培養基：每只栽培瓶中裝小麥粒30 g、蟬幼蟲干粉5 g、純水50 mL，121 ℃滅菌30 min。

細胞培養基：DMEM/F12液體培養基（含10%小牛血清以及100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 蟲草栽培及樣品制備

蟬擬青霉固體斜面種子接入滅菌后冷卻至室溫的三角瓶種子培養基中（500 mL三角瓶裝液量為100 mL、接種量為10%），置入25 ℃恒溫振蕩培養箱，培養5 d備用。蟲草栽培采用圓柱形培養瓶（直徑15 cm、高18 cm）進行，固體物料混勻后按照比例加水，浸泡2 h后進行高溫滅菌（121 ℃，30 min），滅菌結束后冷卻至室溫，將制備好的液體種子按照每瓶10 mL的接種量接入固體培養基表面。接種后的栽培瓶放入20 ℃培養箱避光培養5 d，培養箱溫度調整為25 ℃、光照時間為12 h/d，待培養瓶中產生大量孢梗束，并且孢梗束頂部產生大量孢子時即可采收蟲草部分及收集基質（蟲草采集后剩下的培養基部分）備用。

干燥后的蟬花蟲草孢梗束及基質（粉碎后過10 目篩）分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，甲醇進行提取，提取條件：料液比為1∶10（m/V），超聲波（功率300 W，頻率20 kHz）浸提40 min后過濾收集濾液，各提取相脫除溶劑后采用12.5%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液配成100 μg/mL的樣品溶液，采用0.15 μm孔徑的一次性除菌過濾器過濾后備用。

1.2.2 細胞毒性實驗

細胞培養：將進入對數分裂期的CHO細胞從培養瓶中轉移到96 孔板中培養，以4.0×104個/孔接種，每孔接種量100 μL，接種后的酶標板置于CO2培養箱（CO2體積分數為5%）中37 ℃培養24 h，同時留出3 個空白孔（不加細胞）。待細胞貼壁后，用移液器移出培養液，然后逐孔加入90 μL新鮮培養液和10 μL樣品溶液，同時設置100%陽性對照組、0%空白對照組，100%和0%對照孔中分別加入90 μL新鮮培養液和10 μL 12.5% DMSO（其中100%陽性對照組是3 個無細胞的空白孔），每組設3 個重復，置入5% CO2培養箱中37 ℃培養72 h后，每孔加20 μL 0.05%刃天青，于培養箱中繼續培養2 h，用酶標儀在激發波長530 nm，發射波長590 nm條件下檢測熒光強度。按下式計算腫瘤細胞抑制率。

式中：FLU100%為陽性對照組熒光強度；FLU0%為溶劑空白對照組的熒光強度。

1.2.3 抗腫瘤成分的分離純化和制備

將人工培育蟬花蟲草的乙酸乙酯提取物配成30 mg/mL的甲醇溶液，用0.22 μm孔徑的濾膜過濾后，直接進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析。色譜條件為：色譜柱依利特Hypersil ODS2；進樣量50 μL；洗脫速率3mL/min；流動相0～5 min 100%水，5～20 min 30%乙腈，20～40 min 60%乙腈，40～50 min 100%乙腈，50～60 min 100%水；檢測波長210 nm。采用樣品管按峰收集洗脫相，先在減壓環境下蒸發掉甲醇，然后真空冷凍干燥。干燥后每管加20 μL 12.5%的DMSO溶解后，取10 μL按照1.2.2節方法進行活性測定，確定活性物質的出峰時間，然后多次進樣后收集活性物質色譜峰中間位置的洗脫相。

1.2.4 活性物質的純度及活性驗證

利用薄層層析法和HPLC法進行純度鑒定。

2 結果與分析

2.1 蟬花蟲草的抗腫瘤活性

表1 蟬花蟲草及基質不同有機溶劑提取物對CHO細胞的毒性Table 1 Cytotoxicity of different organic solvent extracts from fruiting bodiess ooff Cordyceps cicaaddaaee and the compost

由表1可知，人工培育蟬花蟲草和野生天然蟬花生藥均具有一定的抗腫瘤活性，并且兩樣品的抗腫瘤成分主要存在于乙酸乙酯提取相和甲醇提取相中，這說明蟬花蟲草中抗腫瘤活性物質主要是中等極性偏強的成分。實驗結果表明，不同有機溶劑提取相抗腫瘤活性差異非常顯著，如人工培育蟬花蟲草乙酸乙酯提取相的抗腫瘤活性極顯著高于石油醚相（P＜0.01），其對腫瘤細胞抑制率達到78.35%，是石油醚相的4.9 倍。另外，發現人工培育蟬花蟲草和基質的不同溶劑提取相均具有一定抗腫瘤活性，其最強活性成分均存在于乙酸乙酯提取相中，經統計分析，人工培育蟬花蟲草和基質的乙酸乙酯提取相對腫瘤細胞的抑制率無顯著差異（P＞0.05）。由實驗結果可以看出，人工培育蟬花蟲草、基質、天然蟬花蟲草生藥均有一定的抗腫瘤活性，為抗腫瘤藥物的開發提供了新藥源。結果發現人工培育蟬花蟲草及基質的甲醇相亦具有很強的抑制腫瘤活性，但是物質的極性相對較強，不利于后期的分離純化，本實驗僅對樣品乙酸乙酯提取相中抗腫瘤活性成分進行進一步的分離純化。

2.2 蟬花蟲草抗腫瘤活性成分的分離制備結果

圖1 人工培育蟬花蟲草（a）和基質（b）乙酸乙酯提取相的HPLC圖Fig.1 Chromatograms of ethyl acetate extracts from cultured fruiting bodies of Cordyceps cicadae (a) and the compost (b)

由圖1可知，人工培育蟬花蟲草和基質乙酸乙酯提取相中成分均較多，并且兩圖色譜峰并不完全一致，但是有些成分的保留時間幾乎完全一致，如在8.8、11、16、24、30 min等多處保留時間均有洗脫主峰出現。

表2 不同HPLC餾分的抗腫瘤活性Table 2 Cytotoxicity assay of HPLC eluates

由表2可知，人工培育蟬花蟲草和基質乙酸乙酯提取相中多個成分均具有一定抗腫瘤活性，其中蟲草乙酸乙酯提取相的抗腫瘤活性成分色譜峰保留時間主要是23.998 min和39.888 min；基質乙酸乙酯提取相抗腫瘤活性成分色譜峰保留時間主要是24.128 min和39.814 min，即兩種提取物中抗腫瘤活性成分的保留時間幾乎一致，為進一步驗證兩樣品中24 min處的洗脫物是否為同種成分，進行薄層層析，發現兩樣品在薄層板上Rf值完全一致，混合后記為樣品1進行點樣，在薄層板上均出現一個斑點，初步判定兩樣品為同一種成分。進一步驗證40 min左右處的兩樣品洗脫相，合并記為樣品2，分析發現兩洗脫組分亦為同種成分，出現這種情況的可能原因是基質樣品中的培養基成分幾乎已被消耗殆盡，其中主要是蟬擬青霉菌絲體，可能菌絲體代謝物中抗腫瘤活性主要成分和子實體中的主要抗腫瘤活性成分是一致的。下一步實驗主要針對人工培育蟬花蟲草乙酸乙酯提取相中抗腫瘤活性成分進行分離。

圖2 樣品1（a）和樣品2（b）的HPLC圖Fig.2 Chromatograms of sample 1 (a) and sample 2 (b)

將人工培育蟬花蟲草乙酸乙酯提取相按照1.2.3節所述方法采用HPLC進行制備，主要收集23.998 min和39.888 min處的洗脫液，為保證樣品純度，主要收集色譜峰中間處的洗脫液，多次收集合并后備用。如圖2所示，將保留時間在30、40 min左右的化合物分別命名為化合物1和化合物2。經與蟲草產品中常見化合物標準品比對，發現化合物1的HPLC峰和薄層色譜（thin layer chromatogram，TLC）圖中Rf值都與蟲草素標準品完全一致。另外，化合物1的紫外光譜具有典型的核苷類260 nm波長處特征峰，因此可確定化合物1的成分為蟲草素。蟲草素是已知的對腫瘤細胞有毒性的物質，但其活性較低，本實驗結果與相關文獻報道一致。化合物2與蟲草產品中常見化合物標準品比對，未發現色譜條件完全一致的成分，初步判定此化合物可能為一種新的化合物或一種已知但不常見的化合物。

2.3 制備樣品純度及活性驗證結果

將制備得到的化合物2經HPLC進行進一步純度驗證，結果見圖3。

圖3 化合物2的純度驗證HPLC圖Fig.3 Chromatogram of compound 2

由圖3可知，采用不同流動相進行洗脫，色譜圖中均只有一個主峰出現，可初步判定該化合物為純品。進一步采用TLC（展開劑為乙酸乙酯-甲醇（8∶2，V/V））對化合物2進行純度分析，結果如圖4所示，薄層板上采用不同顯色劑顯示，均出現一個樣品斑點，由此可初步判定該化合物為純品。

圖4 化合物2的TLC圖Fig.4 TLC chromatogram of compound 2

對收集到的化合物2，脫除溶劑后真空冷凍干燥。干燥樣品以12.5% DMSO溶解稀釋，使樣品質量濃度為500 μg/mL（檢測終質量濃度50 μg/mL），樣品經0.15 μm孔徑一次性過濾器過濾除菌，進行活性驗證。結果發現化合物2在質量濃度為50 μg/mL時，對CHO細胞的抑制率達到（94.55±2.33）%。

3 討 論

蟬花蟲草為一種傳統的滋補佳品，在我國有悠久的應用歷史。近年來，隨著蟬花蟲草應用范圍的擴大，天然蟬花蟲草生藥已經不能滿足市場需求，人工培育的蟬花蟲草已逐步替代天然蟬花蟲草生藥解決了藥源緊缺的問題。目前對人工培育蟬花蟲草的研究報道相對較少，尤其是對人工培育蟬花蟲草抗腫瘤活性的系統研究更是未見報道。本研究發現人工培育蟬花蟲草及天然蟬花蟲草生藥均具有較強的抗腫瘤活性，并且人工培育蟬花蟲草采收后的基質也具有較強的抗腫瘤活性，這說明單純從抗腫瘤活性來說，可以將人工培育蟬花蟲草和培養基質共同使用，不需要單獨分開采收。實驗對蟬花蟲草中抗腫瘤活性成分進行了研究，發現人工培育蟬花蟲草和基質中主要抗腫瘤活性成分為同種化合物。對樣品中的抗腫瘤成分分離過程中發現，人工培育蟬花蟲草抗腫瘤成分主要為兩種，其中一種為蟲草素，另一種化合物在質量濃度為50 μg/mL時對CHO細胞的抑制率達到（94.55±2.33）%。該研究不僅充分證明蟬花蟲草可以作為抗腫瘤藥物或保健品的較佳原料，同時也為蟬花蟲草資源的開發與應用提供了研究基礎。

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Antitumor Activity of Cultured Fruiting Bodies of Cordyceps cicadae

CHEN Anhui1， SHAO Ying1， LI Jiwu2， JIANG Zhaozhi2， CHEN Hongwei1
(1. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe， Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008， China; 2. Bozhou Qiancao Pharmaceutical Co. Ltd.， Bozhou 236800， China)

The antitumor activity of the cultured fruiting bodies of Cordyceps cicadae on Chinese hamster ovary (CHO) cells was investigated by measuring cell viability using a resazurin reduction assay in comparison with that of wild Cordyceps cicadae. The experimental results showed that both samples had antitumor activity and contained mid-polar compounds. Two bioactive compounds, namely components 1 and 2, were separated from the cultured fruiting bodies of Cordyceps cicadae. Component 1 was identifi ed as cordycepin. Component 2 (50 μg/mL) was identifi ed as a purifi ed compound that could inhibit the viability of CHO cells by up to (94.55±2.33)%.

cultivated Cordyceps cicadae; antitumor activity; Chinese hamster ovary (CHO) cells; cordycepin

Q939

A

1002-6630（2015）09-0194-04

10.7506/spkx1002-6630-201509036

2014-06-30

安徽省科技計劃項目（1301C063011）

陳安徽（1979—），男，副教授，博士，研究方向為應用微生物學。E-mail：chenah201@163.com