家蠶繭殼水解粉的急性毒性和遺傳毒性

呂 群，寧文艷，王 智，王玉霞，顧響響，武鵬凱，林 峰，王春梅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

家蠶繭殼水解粉的急性毒性和遺傳毒性

呂 群，寧文艷，王 智，王玉霞，顧響響，武鵬凱，林 峰，王春梅*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的：研究家蠶繭殼水解粉的急性毒性和遺傳毒性。方法：應(yīng)用小鼠急性毒性實驗、體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變實驗、小鼠骨髓細胞染色體畸變實驗及小鼠精子畸變實驗對家蠶繭殼水解粉毒性進行研究。結(jié)果：該家蠶繭殼水解粉對雌雄小鼠半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）均大于11.50 g/kg，屬實際無毒物質(zhì)；基因突變實驗中各受試物劑量組的突變率均沒有達到自發(fā)突變率的3 倍，亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果為陰性；染色體畸變實驗中家蠶繭殼 水解粉各劑量組與陰性對照組無顯著差異（P＞0.05）；精子畸變實驗中，樣品低、中劑量組與陰性對照組 無顯著差異（P＞0.05），而高劑量組畸變率顯著低于陰性對照組（P＜0.05），證明實驗結(jié)果均為陰性。結(jié)論：本次實驗條件下，該家蠶繭殼水解粉屬實際無毒級，未顯示有急性毒性和遺傳毒性作用。

家蠶繭殼水解粉；小鼠；急性毒性；遺傳毒性

家蠶繭殼（silkworm cocoon），又名蠶衣、繭黃，為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼[1]。家蠶繭殼除了用于絲綢工業(yè)外，應(yīng)用于中醫(yī)臨床也歷史悠久，主治便血、尿血、血崩、消渴、反胃、癰腫、疳瘡等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明家蠶繭殼具有降血糖作用[2]。由于傳統(tǒng)家蠶繭殼直接煮水的方法使用效率較低，現(xiàn)代研究者或企業(yè)利用酸堿水解或酶解等工藝將家蠶繭殼進行加工得到了家蠶繭殼水解物[3]，進一步的研究發(fā)現(xiàn)家蠶繭殼水解物具有抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7-8]、抗糖尿病[9-13]、免 疫調(diào)節(jié)[14]、降低血液中的甘油三酯和維持正常肝功能[15-17]等作用。家蠶繭殼主要由纖維狀蛋白質(zhì)“絲心蛋白”，外包以另一種蛋白質(zhì)“絲膠蛋白”黏結(jié)而成[3]。家蠶繭殼經(jīng)水解后得到的產(chǎn)物以氨基酸為主，另外含有一些活性肽[17]。家蠶繭殼水解物已廣泛用于多個品牌的外用美容產(chǎn)品中[18-19]，近來國內(nèi)有研究報道擬將其開發(fā)為抗氧化劑[6]，國外也已經(jīng)有多家公司將其開發(fā)為特殊食品在韓國、日本、俄羅斯和美國等地銷售。已有文獻報道該家蠶繭殼水解粉能提高小鼠體能和雄性生殖功能[20]，給足球運動員服用后，能提高運動員的運動能力并對抗疲勞[21]，顯示了其作為食品或保健品具有巨大開發(fā)潛力，但其用作口服用品的安全性評價沒有文獻報道，這使得開發(fā)者心存顧慮。本研究通過急性經(jīng)口毒性實驗以及遺傳毒性實驗對家蠶繭殼水解粉進行安全性研究，為其進一步市場開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、細胞株與動物

家蠶繭殼水解粉，為淡黃色粉末，主要成分為氨基酸和活性肽，總氨基酸含量≥89.0%，肽含量約為4%，易溶于水，通過酸水解、中和、脫色等基本工藝流程制得[22]，由韓國Worldway有限公司提供。

中國倉鼠肺細胞株（V79），購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

健康昆明種小鼠，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，許可證號SCXK（京）2011-0004，SPF級。實驗動物室室溫（23±3）℃，相對濕度（55±15）%。

1.2 試劑與儀器

大鼠肝勻漿S-9混合物 上海寶錄生物科技有限公司。

Nikon ECLIPSE E200光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

實驗方法與操作程序均按衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）》[23]進行。

1.3.1 小鼠急性毒性實驗

選體質(zhì)量18～22 g小鼠，雌雄各13 只，采用最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）實驗法，實驗前動物禁食16 h，不限飲水。受試樣品劑量設(shè)為230 mg/d（成人使用劑量的100 倍）和最大灌胃容量20 mL/kg（一日內(nèi)1 次或多次給予，一日內(nèi)最多不超過3 次），空白對照組給予同體積蒸餾水。給藥后連續(xù)觀察14 d內(nèi)小鼠的外觀體征、精神狀態(tài)、行為活動、飲水進食、糞便、呼吸、腺體分泌、體質(zhì)量變化及死亡等情況。

1.3.2 遺傳毒性實驗

1.3.2.1 體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變實驗

將5×105個細胞接種于直徑為100 mm平皿中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中放置24 h，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，加入無血清培養(yǎng)液及一定質(zhì)量濃度的受試物（受試物分為高（5.00 mg/mL）、中（3.00 mg/mL）、低（1.20 mg/mL）3 個劑量組，對于陽性對照物的選擇，需要代謝活化的選用苯并芘（10 μmol/L），不需活化的選用甲基磺酸乙酯（1.0 mg/mL））。需代謝活化者同時加入大鼠肝勻漿S-9混合物，置于培養(yǎng)箱中2 h，結(jié)束后吸去培養(yǎng)液，換入含10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)19～22 h、消化計數(shù)，以5×105個細胞接種直徑為100 mm的平皿，3 d后傳代1 次，仍接種5×105個細胞培養(yǎng)3 d，共表達6 d。表達結(jié)束后消化細胞，每組5 皿，每皿2×105個細胞，待細胞貼壁后加入6-TG， 終質(zhì)量濃度為5 μg/mL。培養(yǎng)8～10 d后固定，Giemsa染色，計數(shù)每皿集落數(shù)并計算突變率。同時另做集落形成率測定，每皿接種200 個細胞，不加6-TG，每組5 個皿，7 d后固定染色，計算集落形成率。

1.3.2.2 小鼠骨髓細胞染色體畸變實驗

選體質(zhì)量18～22 g小鼠60 只，隨機分成5 組，每組12 只，雌雄各半，3 個受試物組的劑量分別為11.50、2.88、1.44 g/kg，設(shè)陰性對照組（相同體積的蒸餾水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺0.04 g/kg）。經(jīng)口給予受試物4 次，每次間隔24 h，在末次給受試物后24 h頸椎脫臼處死小鼠。處死小鼠前2 h，按4 mg/kg腹腔注入秋水仙素。取股骨骨髓制片，每鼠觀察100 個分散良好、著色清晰的中期相細胞，每個劑量組觀察1 200 個中期相細胞，計數(shù)染色體畸變率。

1.3.2.3 小鼠精子畸變實驗

選體質(zhì)量25～20 g雄性性成熟小鼠25 只，隨機分為5 組，每組5 只，3 個受試物組的劑量分別為11.60、2.90、1.45 g/kg，設(shè)陰性對照組（相同體積的蒸餾水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺0.06 g/kg）。連續(xù)經(jīng)口給予受試物5 d，均于首次給受試物后的第35天處死動物，取兩側(cè)附睪，制備精子標(biāo)本，高倍鏡下檢查每只動物的精子形態(tài)，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整的不少于1 000 個精子中精子畸形的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，對于計數(shù)資料采用泊松分布和卡方檢驗進行實驗組與對照組的比較分析，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性實驗結(jié)果

給藥后小鼠未見中毒癥狀，小鼠有1 例死亡，經(jīng)剖檢后發(fā)現(xiàn)是由于灌胃失誤導(dǎo)致。14 d后處死動物，觀察小鼠各臟器均未見異常。本品灌胃給藥小鼠的半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）大于11.50 g/kg，表明其無急性毒性，屬實際無毒物質(zhì)。小鼠體質(zhì)量增長情況見表1。

表1 家蠶繭殼水解粉對小鼠急性經(jīng)口毒性體質(zhì)量增長的影響Table 1 Impact of silkworm cocoon hydrolysate powder on body weight in mice in acute oral toxicity test g

2.2 遺傳毒性實驗結(jié)果

2.2.1 體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變實驗結(jié)果

表2 家蠶繭殼水解粉對體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變的影響Table 2 Effect of silkworm cocoon hydrolysate powder on V79/HGPRT gene mutation in vitro

由表2可知，陰性對照組的基因突變率顯著低于陽性對照組（P＜0.05），各受試物劑量組的基因突變率均低于陽性對照組（P＜0.05），并且各受試物劑量組的突變率均沒有達到自發(fā)突變率的3 倍，同時不存在突變率隨劑量遞增而升高的劑量反應(yīng)關(guān)系，由此可判定結(jié)果為陰性，所以家蠶繭殼水解粉對哺乳動物細胞無致突變作用。

2.2.2 小鼠骨髓細胞染色體畸變實驗

表3 家蠶繭殼水解粉對小鼠骨髓細胞染色體畸變的影響Table 3 Effect of silkworm cocoon hydrolysate powder on bone marrow cell chromosome aberration in mice

由表3可知，各個劑量組的染色體畸變率均小于陰性對照組，但無顯著性差異（P＞0.05），陽性對照組的染色體畸變率極顯著高于陰性對照組及各個劑量組（P＜0.01），由此可判定結(jié)果為陰性，所以家蠶繭殼水解粉對小鼠骨髓細胞染色體無致畸作用。

2.2.3 小鼠精子畸變實驗

表4 家蠶繭殼水解粉對小鼠精子畸變的影響Table 4 Effect of silkworm cocoon hydrolysate powder on sperm shape abnormality in mice

由表4可知，陽性對照組的小鼠精子畸變數(shù)極顯著大于陰性對照組及各個劑量組（P＜0.01），陰性對照組與中低劑量組無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組的小鼠精子畸變數(shù)顯著低于陰性對照組（P＜0.05），由此可判定結(jié)果為陰性，所以家蠶繭殼水解粉對小鼠精子無致畸變作用。

3 討 論

《本草綱目》中記載：蠶繭，性甘，味溫，無毒。古方中多用蠶繭煮湯治療消渴癥。蠶繭在加熱過程中會發(fā)生水解反應(yīng)，從而產(chǎn)生類似酸水解的活性產(chǎn)物。本實驗證明家蠶繭殼水解粉是安全無毒的，這也間接證明了蠶繭作為中藥臨床使用的安全性。

迄今為止，未見對蠶繭殼水解物的毒性研究的報道。然而對蠶繭殼的組成成分的毒性相關(guān)的研究有零星的報道，如李加斌[14]在研究絲蛋白肽對小鼠免疫功能的影響時，對BALB/c小鼠進行了急性毒性實驗的研究，結(jié)果表明絲蛋白肽屬無毒物質(zhì)。熊佳慶[24]在利用絲膠蛋白制備肝臟組織工程支架材料時，選用L929小鼠成纖維細胞進行了絲膠（silk sericin，SS）/殼聚糖（chitosan，CS）/甘油磷酸鈉（sodium glycerophosphate，GP）復(fù)合凝膠細胞毒性的系統(tǒng)評價，實驗結(jié)果表明該復(fù)合凝膠無細胞毒性，而且隨著該復(fù)合凝膠中絲膠的含量增大細胞的生長增強。張艷冬[25]在利用絲素蛋白制備藥物緩釋復(fù)合材料時，也選用L929小鼠成纖維細胞對絲素蛋白（silk fibroin peptide，SFP）/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）/聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）復(fù)合材料進行細胞毒性實驗，研究結(jié)果表明該藥物緩釋復(fù)合材料無細胞毒性。以上結(jié)果均表明，家蠶繭殼的水解物是安全無毒的，這為其開發(fā)成為藥品、保健品或生物材料提供了安全依據(jù)。

[1] 王淑芹, 王兆彬, 曲本祥, 等. 蠶繭, 馬齒莧及其聯(lián)合制劑對糖尿病大鼠胰島素抵抗及抗氧化作用的實驗研究[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育, 2009, 7(5): 129-131.

[2] 王自勇, 毛水龍. 蠶繭降血糖作用的實驗研究[J]. 中國醫(yī)藥學(xué)報, 2000, 15(4): 21-22.

[3] 羅美琪. 絲素肽的酶法制備及其生物活性的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2012: 33-42.

[4] 陳力宏. 蠶繭層多肽的制備及其抗氧化活性研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2006: 55-70.

[5] 趙林, 朱義旺, 謝艷招, 等. 蠶絲絲膠蛋白及其水解產(chǎn)物的抗氧化性能研究[J]. 江西化工, 2014(1): 108-111.

[6] 范金波, 任發(fā)政, 孫雁, 等. 絲膠蛋白抗氧化肽的酶法制備及功能評價[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2008, 24(11): 279-283.

[7] CHON J W, JO Y Y, LEE K G, et al. Article: effect of silk fibroin hydrolysate on the apoptosis of mcf-7 human breast cancer cells[J]. International Journal of Industrial Entomology, 20 13, 27(2): 228-236.

[8] 黃慧明. 蠶絲蛋白肽抗腫瘤與抗氧化作用研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 29-40.

[9] 黃國平, 陳克平. 家蠶絲素水解物治療糖尿病的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(25): 13577-13579.

[10] DO S G, PARK J H, NAM H, et al. Silk fi broin hydrolysate exerts an anti-diabetic effect by increasing pan creatic β cell mass in C57BL/KsJ-db/db mice[J]. Journal of Veterinary Science, 2012, 13(4): 339-344.

[11] PARK J H, JUNG H, NAM H, et al. Silk fibroin hydrolysate ameliorates diabetic dyslipidemia in type 2 diabetic model mice[J]. Animal Cells and Systems, 2013, 17(5): 325-330.

[12] KIM E D, BAYARAA T, SHIN E J, et al. Fibroin-derived peptides stimulate glucose transport in normal and insulin-resistant 3t3-l1 adipocytes[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2009, 32(3): 427-433.

[13] LEE H J, LEE H S, CHOI J W, et al. Novel tripeptides with α-glucosidase inhibitory activity isolated from silk cocoon hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(21): 11522-11525.

[14] 李加斌. 絲蛋白肽對小鼠免疫功能的影響[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013: 44-73.

[15] KATO N, SATO S, YAMANAKA A, et al. Silk protein, sericin, inhibits lipid peroxidation and tyrosinase activity[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1998, 62(1): 145-147.

[16] 彭曉虹. 蠶絲氨基酸的組成與功能[J]. 蠶桑茶葉通訊, 2005(3): 12-14.

[17] TANAKA K, MORI K, MIZUNO S. Immunological identifi cation of the major disulfi de-linked light component of silk fi broin[J]. Journal of Biochemistry, 1993, 114(1): 1-4.

[18] 胡桂燕, 王永強, 李有貴, 等. 絲膠蛋白性能及美白防曬乳的研制[J].絲綢, 2010(4): 27-30.

[19] 胡桂燕, 計東風(fēng), 曹錦如, 等. 絲露祛斑美白霜的開發(fā)研究[J]. 絲綢, 2007(7): 18-21.

[20] SHIN S, YEON S, PARK D, et al. Silk amino acids improve physical stamina and male reproductive function of mice[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2010, 33(2): 273-278.

[21] CHOI J H, KIM Y B, YEON S H, et al. Effect of silk amino acid on motor performance and fatigue of soccer players in the college[J]. ???????(教練能力開發(fā)雜志), 2011, 13(1): 189-196.

[22] 曹新志, 李琳琳, 熊俐, 等. 硫酸水解蠶絲蛋白制備絲素肽的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(26): 10828-10831.

[23] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)[M]. 2003: 220.

[24] 熊佳慶. 含絲蛋白肝臟組織工程支架材料的制備及體外評價[D]. 重慶: 重慶理工大學(xué), 2012: 36-48.

[25] 張艷冬. 緩釋性能絲素蛋白的制備及效果評價[D]. 重慶: 重慶理工大學(xué), 2012: 40-45.

Experimental Studies on Acute Toxicity and Genetic Toxicity of Silkworm Cocoon Hydrolysate Powder

L? Qun， NING Wenyan， WANG Zhi， WANG Yuxia， GU Xiangxiang， WU Pengkai， LIN Feng， WANG Chunmei*
(School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China)

Purpose: To observe the acute toxicity and genetic toxicity of silkworm cocoon hydrolysate powder. Methods: Acute oral toxicity test， V79/HGPRT gene mutation test， bone marrow cell chromosome aberration test and sperm shape abnormality test in mice were performed. CTX was used as positive control. Results: The median lethal dose (LD50) of silkworm cocoon hydrolysate powder was more than 11.50 g/kg， which indicated that it was non-toxic. In V79/HGPRT gene muta tion test， the mutation rates of the tested substances at all dose levels did not reach levels 3 times higher than the spontaneous mutation rate; meanwhile， there was no dose-effect relationship， suggesting that the results were negative. In bone marrow cell chromosome aberration test and sperm shape abnormality test， there were significant differences between the positive and negative control groups (P ＜ 0.01)， and between all dose and negative control groups (P ＞ 0.05) except that the aberration rate of the high dosage group was significantly lower than that of the negative control group (P ＜ 0.05) in sperm shape abnormality test. Conclusion: Silkworm cocoon hydrolysate powder is a substance without acute or genetic toxicity in this test.

silkworm cocoon hydrolysate powder; mouse; acute oral toxicity; genetic toxicity

R994.4

A

1002-6630（2015）09-0198-04

10.7506/spkx1002-6630-201509037

2014-07-28

呂群（1992—），女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物活性研究。E-mail：775208465@qq.com

*通信作者：王春梅（1971—），女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物活性研究。E-mail：wchunmei@126.com