3 種方法提取的雨聲紅球藻多糖的理化性質及抗氧化活性比較

劉 楊，王詩卉，劉 云*

（北京化工大學生命科學與技術學院，北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029）

3 種方法提取的雨聲紅球藻多糖的理化性質及抗氧化活性比較

劉 楊，王詩卉，劉 云*

（北京化工大學生命科學與技術學院，北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029）

以雨聲紅球藻（Haematococcus pluvialis）為原料，研究超聲輔助酸提取、超聲輔助堿提取、超聲輔助水提取3 種不同提取工藝對雨聲紅球藻多糖提取效率和產品理化特性的影響，在此基礎上對3 種多糖抗氧化活性進行比較分析。結果表明，3 種提取方法所得多糖提取率大小依次為：超聲輔助堿提法（9.52%）＞超聲輔助酸提法（1.50%）＞超聲輔助水提法（1.29%）。傅里葉紅外變換光譜分析結果表明，3 種多糖的組成單糖中均包含吡喃糖，成苷的半縮醛羥基主要為α構型，其中以酸提多糖的吸收峰最強。掃描電子顯微鏡證實了超聲輔助堿提法對雨聲紅球藻細胞壁的破壞程度最大，胞內多糖溶出最多。通過對還原力、1′1-二苯基-2-苦基肼自由基清除能力和·OH清除能力等抗氧化活性的測定，表明3 種多糖均具有一定的抗氧化能力，其中以堿提多糖的綜合抗氧化能力最優。由此可見，超聲輔助堿提法是一種提取藻多糖較好的方法。

雨聲紅球藻多糖；超聲輔助提取；理化特性；抗氧化

生物多糖是一類在自然界中廣泛存在的天然大分子化合物，在心血管疾病、肝炎的治療以及抗腫瘤、抗氧化、抗凝等方面均呈現出了獨特的生理活性，且有著非常低的細胞毒性。因此，生物多糖不但可以增強機體的免疫力，而且還能增強機體的抗氧化能力[1-2]。隨著對海洋資源的深入研究，發現海洋中的海藻、蝦殼素、微生物等來源的活性多糖，是開發海洋生物功能性食品、尋找新型多糖藥物先導化合物的寶貴資源[3-4]。

雨聲紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細胞綠藻，隸屬綠藻門、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬。主要作為天然蝦青素來源，用于蝦青素的有關研究[5-6]。目前，國內外對雨聲紅球藻多糖的研究報道不多，馮以明等[7]依次采用冷水法、熱水法和熱堿法分級提取雨聲紅球藻多糖，得率均不高，分別為2.74%、1.36%及1.55%；通過高效液相色譜法、紅外光譜法等對分級純化后的3 種冷水提多糖的單糖組成、相對分子質量和基本結構特征進行了 分析，結果表明，雨聲紅球藻多糖的單糖種類復雜，主要含有11 種單糖，其中半乳糖含量最高，大于20%；冷水法、熱水法所得多糖的硫酸基及糖醛酸相對含量均低于堿提多糖。分級所得3 種冷水提多糖的相對峰位分子質量分別為502.6、373.2，577.5、300.5 ku。Park等[8]在研究雨聲紅球藻多糖時，發現雨聲紅球藻多糖是一種酸性多糖；經瓊脂糖CL-6B柱層析和體積排阻色譜法純化后，測得其單糖組成包括半乳糖、葡萄糖和甘露糖，相對物質的量比率為2.0、1.0和4.1；多糖中硫酸酯含量為1.08%，未檢測到蛋白質及酚類物質；同時發現，雨聲紅球藻多糖有較好的免疫活性，可以激活小鼠巨嗜細胞RAW264.7分泌促炎性細胞因子，呈劑量依賴性，且沒有細胞毒性。Rodríguez-Meizoso等[9]采用亞臨界水萃取技術提取雨聲紅球藻中可以用作功能食品原料的天然生物活性類物質，發現當提取溫度為200 ℃時，提取率最高，大于30%；通過Trolox等價抗氧化能力（Trolox equivalent and oxidant capacity，TEAC）法研究提取物的抗氧化能力，結果表明，提取物的抗氧化能力與雨聲紅球藻中的糖類物質在高溫條件下產生的焦糖化反應產物及美拉德反應產物有關。

多糖的提取方法可分為溶劑提取法、酸提法、堿提法、生物提取法、強化提取法。其中，水提法是一種傳統的提取方法，該法不需復雜的設備，成本低，安全無毒害，適合大規模工業化生產。但因水的極性大，易引入蛋白質等雜質。酸堿提取法是在水提法的基礎上衍生出來的多糖提取方法，在一定程度上提高了提取率，但操作中應對濃度加以控制，防止造成多糖的降解[10]。酶法具有條件溫和、雜質易除和提取率高等優點。但是該法成本較高，并且對反應條件要求較苛刻。超臨界流體萃取法的優點是傳質速率高、穿透力強、萃取效率高，缺點是設備復雜，成本高。超聲波輔助提取多糖的過程是一種物理破碎過程，它利用空化和機械振動作用瞬間使細胞壁結構破裂，提高了多糖的提取率，同時還能產生乳化、熱效應等，加速了植物有效成分的擴散[11]。且該法具有能耗低、效率高等優點，在實際生產中得到了廣泛的應用。雨聲紅球藻厚壁孢子堅韌的細胞壁阻礙了對胞內目的產物的提取，從而降低了生物利用度[9]。研究[12]表明超聲輔助提取法可以通過破壁增強雨聲紅球藻細胞內生物活性物質的溶出。

本實驗比較了超聲輔助酸提法、超聲輔助堿提法和超聲輔助水提法3 種不同提取工藝對雨聲紅球藻多糖的提取效果，并對所提多糖產品的理化性質進行了全面考察，以期為雨聲紅球藻多糖的綜合開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨聲紅球藻（Haematococcus pluvialis）由云南愛爾發生物技術有限公司饋贈。

1′1-二苯基-2-苦基肼（1′1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH，分析純） 上海Aladdin公司；2′6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT，化學純）、酒石酸甲鈉、α-萘酚（分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司；乙醇、丙酮、葡萄糖、氯化鐵（分析純） 北京化工廠；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA，分析純） 天津市大貿化學試劑廠；半乳糖醛酸（分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-756CRT型紫外分光光度計 上海佑儀儀器儀表有限公司；Vector22型紅外光譜儀 德國Bruker公司；3K15型冷凍離心機 美國Sigma公司；SB-5200超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S型水浴恒溫磁力攪拌器 鞏義予華儀器有限公司；SU-1510型掃描電鏡 日本Hitachi公司；SH-D（Ⅲ）型真空泵 河南予華儀器有限公司；DHG-9070A型干燥箱 北京陸希科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取與純化

雨聲紅球藻藻粉于90 ℃烘箱中烘干，乙醇-乙酸乙酯（1∶2，V/V）浸泡12 h脫脂，烘干。取3 份脫脂藻粉，分別加入40 倍體積的去離子水、稀堿（4% NaOH溶液，pH 14）、稀鹽酸（pH 3），于55 ℃，超聲功率200 W條件下，提取2 h，重復2次。提取液中加入3 倍體積的95%乙醇溶液，靜置過夜，5 000 r/min離心15 min，沉淀用去離子水溶解后采用TCA法脫蛋白[13]，調節pH值至中性后將提取液置于截留分子質量為8 000 D的透析袋內于流動的去離子水中透析48 h除去小分子雜質，旋轉蒸發濃縮至原體積的1/5，最后經冷凍干燥依次得水提多糖、堿提多糖和酸提多糖。

1.3.2 雨聲紅球藻多糖的一般理化特性分析

總糖含量測定：以葡萄糖為標準品采用苯酚-硫酸法[14]對總糖含量進行測定，準確稱取標準葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻后分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，再加入蒸餾水補至2 mL，然后加入5%苯酚1 mL及濃硫酸5 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min后于490 nm波長處測吸光度，以2 mL蒸餾水同樣處理作為對照。多糖提取率按式（1）計算。

α-萘酚實驗：取粗多糖10.0 mg，加入1.0 mL去離子水溶解，加2 滴15% α-萘酚乙醇溶液，混合搖勻后，沿管壁緩緩加入硫酸0.5 mL，將試管靜置10 min后50 ℃水浴5 min，觀察在兩液面交界處有無紫紅色環出現。

斐林實驗：取4.0 mL多糖溶液置于試管中，加5%鹽酸1.0 mL，沸水浴15 min，室溫靜置冷卻，加酚酞指示劑1 滴，用10% NaOH試液中和至中性，加入斐林試劑（堿性酒石酸銅溶液）4～5 滴，50 ℃水浴5 min，觀察是否生成棕紅色沉淀。

I2-KI顏色反應：取1 mL質量濃度為1 mg/mL的多糖溶液加入I2-KI溶液，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照，淀粉溶液（1 mg/mL）作陽性對照。

FeCl3反應：取待測多糖溶液1 mL加入1% FeCl3溶液0.6 mL，觀察溶液是否呈藍墨綠色。

考馬斯亮藍反應：取0.01 g/mL的溶液1 mL加入考馬斯亮藍G-250試劑5 mL，觀察其變色情況[15]。

糖醛酸的測定：以半乳糖醛酸為標準品采用間羥聯苯法測定[16]。

1.3.3 不同提取方法所得多糖的紫外吸收光譜分析

將3 種多糖分別配制成0.01 g/mL的溶液，以去離子水為空白對照，采用UV-756CRT型紫外分光光度計于200～400 nm的波長范圍內進行紫外掃描。

1.3.4 不同提取方法所得多糖的紅外光譜分析

采用KBr壓片法。取100 mg干燥KBr粉末研細，加入多糖樣品0.5 mg混合研細，壓成透明薄片。Vector22型紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數范圍內進行測定。紅外光譜儀測定參數：分辨率：4.0 cm－1；背景掃描次數：32 次；檢測器：氘化硫三肽。

1.3.5 不同方法提取后雨聲紅球藻細胞壁掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）分析

不同的提取條件對雨聲紅球藻細胞壁結構的影響是不同的。SEM可以揭示物質的微細結構[17]。分別對未經過任何處理的雨聲紅球藻樣品和采用3種不同超聲輔助法提取及在其他條件相同情況下分別僅經過稀鹽酸溶液（pH 3）、去離子水及堿溶液（4% NaOH溶液）浸提后的雨聲紅球藻樣品進行SEM分析。首先將藻粉脫水固定，采用2.5%戊二醛溶液浸泡2～4h，之后用磷酸緩沖液清洗3次，再經乙醇梯度脫水，分別用30%、50%、70%、85%、95%的乙醇溶液各浸泡1 次，再用100%乙醇浸泡2 次，每次浸泡15～20 min。將脫水后的藻粉低溫冷凍干燥12 h。最后對藻粉樣品通過離子濺射噴金，采用SU-1510型掃描電子顯微鏡在低真空條件下測定。SEM測定參數：電子加速電壓5.00 kV；放大倍數400 倍。

1.3.6 不同提取方法所得多糖的體外抗氧化活性測定1.3.6.1 還原力的測定[18]

分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的3 種多糖溶液各1.0 mL，依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和1.0 mL K3Fe(CN)6溶液（1%），后將混合液于50 ℃條件下恒溫反應20 min，急速冷卻，接著向混合物中加入1.0 mL 10%的TCA溶液，3 000 r/s離心10 min后取2.5 mL上清液，再依次加入2.5 mL蒸餾水、1.2 mL FeCl3（0.1%）。

以蒸餾水為參比在700 nm波長處測定吸光度，取質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）進行同樣處理并作為陽性對照。混合溶液的吸光度增加，表明還原能力增強。

1.3.6.2 羥自由基（·OH）清除能力的測定[19]

分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的3 種多糖樣品水溶液1.0 mL，然后依次加入1.0 mL FeSO4（9 mmol/L），1.0mL水楊酸（9 mmol/L）和1.0 mL 9 mmol/L的H2O2，搖勻，37 ℃條件下反應30 min。以蒸餾水作為參比在510 nm波長處測吸光度記為A1，以去離子水代替樣品作為待測溶液，相同條件下測定吸光度記為A0；取質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的BHT進行同樣處理并作為陽性對照。·OH清除率計算見式（2）：

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力的測定

分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的3 種多糖水溶液2.0 mL，加入2.5 mL DPPH-DMSO溶液（100 μmol/L），室溫條件下反應30 min，以蒸餾水為參比，在517 nm波長處測量各質量濃度糖液的吸光度記為A1，以去離子水代替多糖，相同條件下測定的吸光度記為A0；對相同質量濃度的BHT進行同樣處理作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算見式（3）[20-21]：

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對雨聲紅球藻多糖理化特性的影響

實驗中詳細比較了超聲輔助酸提法、超聲輔助水提法、超聲輔助堿提法3 種不同提取工藝對雨聲紅球藻多糖一般理化特性的影響，結果見表1。

表1 3 種提取方法所得多糖的提取率及基本理化性質比較Table1 Comparison of the yields and basic physicochemical characteristics of polysaccharides extracted from H. pluvialis by thhrreeee extraction methooddss..

冷凍干燥后的酸提多糖和水提多糖均為白色絮狀物，而堿提多糖卻呈現為淺黃色絮狀物；3 種多糖產品均可溶于水以及稀酸、稀堿溶液當中，都不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑。酸提多糖、水提多糖得率分別為1.5%和1.29%，與文獻[7]報道相當，堿提多糖的得率最高（9.52%），高于文獻[7]報道的1.55%。分析原因可能是由于超聲波的輔助萃取提高了對細胞壁的破碎力度，加快了反應速度，故胞內溶出物更多。Wu Guanghong等[22]曾報道有些多糖尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖，在堿液中有更高的提取率。上述實驗結果與該結論一致。由表1可知，苯酚-硫酸測試和α-萘酚測試的結果均呈陽性，表明這3 種組分具有一般多糖的性質；堿提多糖的I-KI反應呈陽性，表明其中含有淀粉，可能是淀粉性多糖，酸提多糖、水提多糖則均為非淀粉多糖；考馬斯亮藍反應呈陽性，表明3 種多糖樣品中可能含有糖蛋白；3 種多糖的斐林測試、FeCl3反應結果均為陰性，說明它們不含單糖、多酚類物質；間羥聯苯反應結果表明3 種多糖均含有糖醛酸，可能是酸性多糖，與Park等[8]所報道的結果一致。

圖1 雨聲紅球藻多糖的紫外光譜分析Fig.1 UV absorption spectra of the three H. pluvialis polysaccharides

紫外光譜分析（圖1），超聲輔助酸提法、超聲輔助堿提法、超聲輔助水提法3 種方法所得雨聲紅球藻多糖產品在260 nm和280 nm波長處均沒有核酸、蛋白質的特征峰，可能是其含量較低所致。

2.2 不同提取方法所得多糖的傅里葉紅外變換光譜分析

對超聲輔助酸提法、堿提法和水提法所得3 種多糖及原料進行了紅外光譜掃描分析，結果如圖2和表2所示。

圖2 不同提取方法所得多糖及雨聲紅球藻原料的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of H. pluvialis and the three polysaccharides

研究[23]表明紅外吸收光譜可以用來檢測糖類中功能基團，據此可以判斷糖鏈上的主要取代基，有關單糖組成、糖環構型、半縮醛羥基構型等結構信息也可通過紅外光譜圖獲得。

表2 雨聲紅球藻及3 種多糖的紅外光譜分析Table2 Infrared spectral analysiss ooff H. pluvialis aanndd the three polysacchariiddeess

如圖2所示，不同提取方法所得多糖的紅外光譜圖基本相似，說明3 種多糖在化學結構上類似。原料藻粉及3 種雨聲紅球藻多糖在3 600～3 200 cm—1處均存在強寬吸收峰，為糖類—OH的伸縮振動；3 000～2 800 cm—1（2 887、2 889、29 26 cm—1）處的吸收峰為—CH的伸縮振動，其中超聲輔助酸提多糖的吸收峰比超聲輔助堿提多糖和超聲輔助水提多糖強，說明超聲輔助酸提多糖中有較多的—CH結構[24]；在1 636 cm—1及1 639 cm—1處，超聲輔助酸提多糖、水提多糖和堿提多糖的譜圖中各自有一不太尖的峰，為酰胺基的吸收峰[24]；1 150～1 000 cm—1為C—O—C環內醚C—O伸縮振動和C—O—H變角振動所引起的吸收[25]，超聲輔助酸提多糖在1 110 cm—1處的吸收強于水提及堿提多糖；在糖類的環振動吸收區900～700 cm—1，可觀察到843 cm—1處3 種提取方法所得多糖均呈現特征吸收，并以超聲輔助酸提多糖吸收峰最強，說明組成單糖中包括吡喃糖[25]，成苷的半縮醛羥基主要為α構型。

2.3 不同提取方法對雨聲紅球藻細胞壁的SEM分析

如圖3所示，多糖提取前后的雨聲紅球藻細胞壁形貌差異明顯。提取前雨聲紅球藻細胞壁表面光滑，無折痕或裂痕（圖3A）。而經超聲輔助酸、堿提取多糖后的雨聲紅球藻細胞壁表面出現不規則褶皺，表面積增大，有利于多糖從細胞內溶出。Zhang Zuof a等[26]研究超聲輔助法提取金針菇中的活性多糖時，通過SEM分析表明，提取后細胞壁受到嚴重破損，而未經超聲輔助法提取的材料其細胞壁較完好。李輝等[27]比較了超聲輔助法和常規回流法提取白背三七總黃酮，SEM證明了超聲處理后的植物葉片表面損傷嚴重，而常規回流處理后的葉片表面仍較完整，表明超聲波與溶劑中的植物材料作用時，對其細胞壁具有較強的破壞作用。

目前普遍認為，超聲輔助提取是多糖提取的一種有效方法[28]。超聲波可致物料和溶液的接觸面間形成空穴，氣泡的瞬間形成和破裂產生極大壓力可以造成細胞壁的破裂，同時伴隨熱效應和機械作用對介質中的懸浮細胞造成剪切應力，加速傳質[29]。本實驗中，經過超聲輔助水提取后的雨聲紅球藻細胞壁表面出現褶皺（圖3C）。而經超聲輔助酸、堿提取后的雨聲紅球藻細胞壁表面塌陷和褶皺程度更加明顯（圖3B和3D），從而加速多糖從胞內溶出。這與表1多糖提取得率結果一致。

圖3E～G依次為不施加超聲波輔助作用下雨聲紅球藻經酸溶液（pH 3的稀鹽酸）、去離子水及堿溶液（4%的NaOH溶液）浸提后的SEM圖。如圖3E所示，少量紅球藻細胞壁呈現褶皺，圖3F中幾乎沒有表面褶皺的紅球藻，圖3G中大部分紅球藻細胞壁均呈現褶皺。對比圖3B及3E，可知酸堿對雨聲紅球藻細胞壁有一定的破壞作用，但不及在超聲波協同作用下的效果明顯。酸、堿法有助于解除細胞壁聚合物分子間的物理和化學作用，使不溶性纖維素、木質素、半纖維素與果膠多糖之間的化學鍵斷裂，從而提高多糖產率。趙晨淏等[30]研究不同提取方法對龍眼多糖性質的影響時，發現堿溶液會導致細胞壁破損更嚴重，利于胞內多糖的溶出。Xue Fang等[31]研究超聲輔助熱水法、超聲輔助熱堿法提取花生多糖，發現超聲熱水提取后花生粕細胞壁斷裂為不規則片狀，而超聲熱堿提取后的花生餅粕粉末表面有多處塌陷，細胞壁已經完全破碎。這與本實驗結論相一致。

2.4 不同提取方法所得多糖的體外抗氧化活性比較2.4.1 還原力測定結果

Fan Liuping等[32]研究發現合成化合物及天然提取物的還原能力是反映其抗氧化活性的一個有效指標。抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，其抗氧化活性與還原力呈正相關，還原能力越大，抗氧化活性越強[33]。

圖4 BHT和3 種雨聲紅球藻多糖的還原力Fig.4 Reducing power comparison of BHT and the three polysaccharides from H. pluvialis

如圖4所示，3 種方法提取雨聲紅球藻多糖的還原力（A700nm值）均隨多糖質量濃度的增加而逐漸增強，其中超聲輔助水提多糖的還原能力最高，超聲輔助堿提多糖次之，超聲輔助酸提多糖最弱，當3 種多糖質量濃度達到5 mg/mL時，其吸光度分別為0.207、0.156和0.131。以上結果表明，3 種提取方法得到的雨聲紅球藻多糖均具有一定的還原力，但與BHT相比較弱。類似的，Zhang Zuofa等[26]研究了金針菇多糖的還原能力，發現質量濃度為5 mg/mL的金針菇多糖在700 nm波長處的吸光度低于0.2，與陽性對照丁基羥基茴香醚同樣具有較大差異。Kozarski等[34]研究藥用真菌多糖的還原能力時，發現當靈芝多糖的質量濃度為5 mg/mL，其吸光度約為0.23。此外，Lu Xinshan等[18]在研究黃山毛峰多糖的還原力時以BHT作為陽性對照，當BHT的質量濃度在0.01～0.05 mg/mL之間時，A700nm在0.6～2.3之間，與本實驗結果一致。

2.4.2 ·OH的清除效果

·OH的檢測對自由基的生物作用研究而言非常重要。·OH是已知活性最強的活性氧自由基，易穿過細胞膜，直接作用于細胞內的蛋白質、脂質、DNA等生物分子，引起組織損傷或細胞死亡。因此，清除·OH可能是保護生命系統的有效方式[35]。多糖抗氧化機制可能是通過糖醛酸與亞鐵離子耦合抑制·OH的產生，提高還原力[36]。同時也可能通過提供氫原子，與·OH結合成水，達到清除自由基的作用。

圖5 BHT和3 種雨聲紅球藻多糖的?OH清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of BHT and the three polysaccharides from H. pluvialis

由圖5可知，當多糖的質量濃度在1～3 mg/mL之間時，其對·OH的清除能力隨質量濃度的升高而增大，呈現劑量依賴性；但當質量濃度高于3 mg/mL后，其清除率基本不再變化，說明該質量濃度為清除·OH的最佳質量濃度，在本實驗最高質量濃度下（5 mg/mL），超聲輔助堿提多糖對·OH的清除作用最強（6.85%），超聲輔助水提多糖次之（5.75%），超聲輔助酸提多糖最弱（4.73%）。Wu Guanghong等[22]用堿提法得到的菌核側耳多糖對·OH的清除率為水提多糖的 1.2 倍，說明堿液提取方法可能更有利于酸（活）性多糖溶出。Huang等[37]研究了茶樹菇子實體和發酵液提取物的抗氧化活性，發現當質量濃度為5 mg/mL時清除率分別為3.82%和3.56%，均低于雨聲紅球藻多糖。此外，Pan Yingming等[38]以BHT作為陽性對照，當BHT質量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內時其·OH清除率在5%～20%之間與本實驗研究結果基本一致。

在本實驗中，當多糖質量濃度在1～2 mg/mL時，酸提多糖的·OH清除率高于另外2 種多糖，而當質量濃度高于3 mg/mL后，超聲輔助堿提多糖的清除率最高，造成該現象的原因主要是超聲輔助酸提多糖中包含較多的—CH基團（2.2節）。當多糖質量濃度較低時，超聲輔助酸提多糖主要以單體形式存在于溶液中，而當多糖質量濃度提高時，過多的—CH基團導致酸性多糖聚集成簇從而降低整個體系的熵。簇的存在降低了·OH和酸性多糖的可及性，從而減弱了酸性多糖的·OH清除率[39]。

2.4.3 DPPH自由基清除作用

DPPH自由基是一種很穩定的以氮為中心的有機自由基，其孤對電子在517 nm波長附近有強吸收；當有抗氧化劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱，溶液由紫色變為淺黃色[40]。因此可以通過測定吸收減弱的程度，來評價抗氧化劑的抗氧化活性。對BHT和3 種不同方法提取所得雨聲紅球藻多糖的DPPH自由基清除能力的研究結果如圖6所示。

圖6 BHT和3 種雨聲紅球藻多糖的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activities of BHT and the three polysaccharides extracted from H. pluvialis

3 種多糖均表現出質量濃度與自由基清除作用間的量效關系，即在一定質量濃度范圍內，隨著多糖質量濃度的增加其對DPPH自由基的清除作用也隨之增強。當雨聲紅球藻多糖質量濃度為5mg/mL時，超聲輔助堿提多糖對DPPH自由基的清除率達到62.78%，分別是超聲輔助水提多糖的5.5 倍和超聲輔助酸提多糖的2.3 倍。徐懷德等[41]研究超聲波輔助提取的光皮木瓜多糖對DPPH自由基的清除能力，發現當多糖質量濃度為8 mg/mL時，光皮木瓜多糖對DPPH自由基的清除率可達到74.68%，高于同質量濃度下VC對DP PH自由基的清除率。Hua Dehong等[42]研究山桃草果實多糖清除DPPH自由基的能力，結果表明：山桃草多糖具有DPPH自由基清除活性，當質量濃度為5 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率接近30%。由此可知，5 mg/mL的堿性多糖的清除率略低于8 mg/mL的光皮木瓜多糖，但是遠高于同質量濃度下的山桃草果實多糖，說明超聲輔助堿提多糖在DPPH自由基清除方面有潛在的應用價值。類似的，超聲輔助酸提多糖和超聲輔助水提多糖也有一定的DPPH自由基清除作用。

3 結 論

比較了超聲輔助酸提取、超聲輔助水提取、超聲輔助堿提取3 種方法對雨聲紅球藻多糖的提取效果及所得3 種多糖的理化性質，進一步對多糖的體外抗氧化活性進行了比較分析。結果表明，超聲輔助酸提法、超聲輔助水提法及超聲輔助堿提法的多糖提取率依次是1.50%、1.29%、9.52 %。3 種多糖的組成中均包括糖醛酸；超聲輔助堿提法所得多糖是淀粉性多糖，其他2 種為非淀粉性多糖；3種方法所得多糖中均不含單糖、多酚類物質，但其組成單糖中均包含吡喃糖，成苷的半縮醛羥基主要為α構型，其中以超聲輔助酸提多糖的吸收峰最強。傅里葉紅外變換光譜顯示，3 種多糖組成基本相似。SEM結果顯示，超聲輔助堿提法對雨聲紅球藻細胞表面形態影響最大，多糖釋放最充分。超聲輔助堿提多糖對DPPH自由基有較好的清除效果，清除率達60%以上；對·OH的清除能力也強于其他兩種多糖；還原力表現為超聲輔助水提多糖＞超聲輔助堿提多糖＞超聲輔助酸提多糖。綜合分析，超聲輔助堿提法所得雨聲紅球藻多糖提取率和抗氧化活性最高。

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Physicochemical Properties and Antioxidant Activity of Polysaccharide Extracted from Haematococcus pluvialis with Three Different Methods

LIU Yang WANG Shihui LIU Yun*
(Beijing Key Laboratory of Bioprocess College of Life Science and Technology Beijing University of Chemical Technology Beijing 100029′China)

Three different methods ultrasonic-assisted acid extraction ultrasonic-assisted alkali extraction and ultrasonicassisted water extraction were compared to extract polysaccharides from Haematococcus pluvialis with respect to yield and physicochemical characteristics The results showed that polysaccharide yield decreased in the following order alkali extraction (9.52%) ＞ acid extraction (1.50%) ＞ water extraction (1.29%). Scanning electron microscopy (SEM demonstrated that the cell wall of algae was most seriously damaged by ultrasonic-assisted alkali extraction leading to the largest amount dissolved polysaccharides In addition the polysaccharides extracted by ultrasonic-assisted acid extraction had the strongest absorption peaks on Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR spectra and all the three polysaccharides contained pyranose monomers in their structures The main hemiacetal hydroxyl was α configuration The antioxidant analyses of 1′1-dipheny1-2-picrylhydrazyl (DPPH)′hydroxyl radical scavenging activities and reducing power testes showed that the polysaccharides extracted by these three methods all presented some natural antioxidant activities Among them the polysaccharide extracted by ultrasonic-assisted alkali extraction showed the strongest antioxidant activity It is concluded that ultrasonic-assisted alkali extraction is an effective method for extracting polysaccharides from H. pluvialis.

Haematococcus pluviali polysaccharide ultrasonic-assisted extraction physicochemcial properties antioxidant activity

TS202.1

A

1002-6630（2015）06-0161-08

10.7506/spkx1002-6630-201506030

2014-06-15

北京市自然科學基金項目（5142013）

劉楊（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然活性成分及其與蛋白質相互作用機理。E-mail：liuyangtjbd@126.com

*通信作者：劉云（1972—），男，教授，博士，研究方向為生物煉制、食品科學。E-mail：liuyun@mail.buct.edu.cn