超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測牛乳中4 種驅(qū)蟲藥物殘留

侯改成，譚艾娟*，呂世明，金曉峰，張劍勇

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州省獸藥監(jiān)察所，貴州 貴陽 550003）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測牛乳中4 種驅(qū)蟲藥物殘留

侯改成1，譚艾娟2,*，呂世明3，金曉峰4，張劍勇4

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州省獸藥監(jiān)察所，貴州 貴陽 550003）

建立同時檢測牛乳中4 種驅(qū)蟲藥物（吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素）殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，堿性氧化鋁固相萃取小柱凈化，采用UPLC ACQUITY BEH C18柱，以0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-5.0 mmol/L乙酸銨（B）為流動相，梯度洗脫分離，在電噴霧正離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測。結(jié)果表明：4種驅(qū)蟲藥物在5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.996，加標樣品的平均回收率為76.4%～113.3%，相對標準偏差（n=6）為2.4%～10.6%。吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素的檢出限分別為1.0、2.5、2.5、2.5 μg/kg。該方法簡便、快速、準確，可以同時檢測牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素殘留。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；吡喹酮；阿維菌素類藥物；殘留；牛乳

阿維菌素類藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是目前公認的高效、廣譜抗寄生蟲類藥物[1]。阿維菌素類藥物主要包括阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素[2]，該類藥物對動物體內(nèi)的線蟲和體外吸血昆蟲有極強的驅(qū)殺作用[3]，但對吸蟲和絳蟲無效[4]。該類化合物對未成年人的腦和脊髓有較強的毒性，甚至?xí)鹚劳鯷5]。美國、歐盟、日本和中國等均制定了限定阿維菌素類藥物殘留的相關(guān)規(guī)定[6-7]。吡喹酮是驅(qū)除動物體內(nèi)吸蟲和絳蟲的首選藥[8]，但在食品中的殘留會引發(fā)諸多的副作用，給人類的生命健康帶來嚴重威脅[9-10]。

由于奶牛為食草動物，多為線蟲、絳蟲、吸蟲以及各種體外寄生蟲混合感染[11]，使用單一藥物驅(qū)蟲效果不理想，臨床上常常將阿維菌素類藥物與吡喹酮聯(lián)合用于奶牛體內(nèi)蠕蟲和體外寄生蟲的驅(qū)除，驅(qū)蟲效果好，簡便、經(jīng)濟[12-14]，因此，牛乳中同時出現(xiàn)此兩類藥物殘留的機率較高，目前牛乳中獸藥殘留的檢測主要涉及氟喹諾酮類藥物、β-類酰胺類藥物、氯霉素、黃曲霉毒素等，有關(guān)阿維菌素類藥物和吡喹酮檢測方法的研究報道較少[15-17]，還未見到同時檢測牛乳中此兩類藥物殘留的相關(guān)報道。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素藥物殘留的方法，該方法為鮮乳生產(chǎn)企業(yè)、乳產(chǎn)品加工企業(yè)和食品安全監(jiān)管部門加強原料乳收儲、產(chǎn)品質(zhì)量控制，降低牛乳中阿維菌素類藥物和吡喹酮殘留的危害、保障牛乳安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡喹酮（純度99.5%）、阿維菌素（純度95.0%）、多拉菌素（純度96.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；伊維菌素（純度93.9%） 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；甲醇、乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純）上海安譜科學(xué)儀器有限公司；水為超純水；正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸銨、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC超高效液相色譜、Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Waters公司；堿性氧化鋁固相小柱（500 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司；氮氣吹干儀 美國Organomation公司；3K15離心機 美國Sigma公司；渦旋混合器 德國IKA公司；XS105電子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液制備

分別準確稱取一定量的標準品，用甲醇溶解于100 mL棕色容量瓶中，4 ℃條件下避光保存[18]，備用。使用前移取適量標準儲備液，用乙腈稀釋成所需質(zhì)量濃度的混合標準液。

1.3.2 樣品處理

準確稱取1 g樣品（精確至0.01），置于50 mL離心管中，先加入5 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻，繼續(xù)加入5 mL×2乙腈，渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，合并二次上清液至堿性氧化鋁固相小柱上，凈化液收集于50.0 mL氮吹管中，45 ℃氮氣吹干，準確加入1.0 mL乙腈，充分渦旋并超聲溶解后過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧（electrospray ionization，ESI）正離子源；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細管電壓：3.5 eV；離子源溫度：120 ℃；溶劑氣溫度：350 ℃。

表1 吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table1 Mass spectral parameters for PZQ IVR AVB and DOR

1.3.4 色譜條件

Waters UPLC ACQUITY BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：乙腈-0.1%甲酸；流動相B：0.1%甲酸-5.0mmol/L乙酸銨；梯度洗脫程序：0～1.0 min，50% B；1.0～3.5 min，90% B；3.5～3.7 min，90% B；3.7～4.3 min，50% B。柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

4 種驅(qū)蟲藥物均屬弱極性化合物，在乙酸乙酯、乙腈等有機溶劑中有較高的溶解度。實驗考察A為乙酸乙酯，B為乙腈，C為乙腈-二氯甲烷（8∶2，V/V），D為乙腈-二氯甲烷（6∶4，V/V），4 種提取劑在添加量為5 μg/kg的提取效率，如表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯容易引起乳化，回收率普遍較低；在乙腈中加入不同比例的二氯甲烷雖有助于沉淀蛋白和水相的分離，但回收率也普遍較低，并對人和環(huán)境危害較大[19]；通過加入飽和氯化鈉改善有機相和水相的分離[20]，再經(jīng)乙腈提取后4 種驅(qū)蟲藥物的回收率普遍較高，且雜質(zhì)少，基質(zhì)干擾小。

表2 4 種提取劑的提取效率對比（n==66）Table2 Comparison ofnn == 66))

2.2 凈化方法的確定

凈化方法主要包括固相萃取和液液萃取[21]。固相萃取選用堿性氧化鋁固相萃取小柱，液液萃取選用正己烷，由于正己烷在乙腈中有一定的溶解度，考慮到上機溶液需與流動相有良好的適配性，因此選用乙腈飽和的正己烷凈化。堿性氧化鋁固相萃取小柱能更有效地凈化富含脂肪的牛乳樣品，降低非極性雜質(zhì)對測定結(jié)果的影響，消除了基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾，效果較理想。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 4 種驅(qū)蟲藥物在添加量10 10μg/kg的牛乳中的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 4 parasiticides spiked in milk at 10 μg/kg

質(zhì)譜檢測主要采用ESI—和ESI＋模式。ESI—靈敏度較低，阿維菌素類藥物均未檢出。ESI＋又分為[M＋Na]＋和[M＋NH4]＋模式，結(jié)果表明，[M＋Na]＋的離子化效率和響應(yīng)值雖然很高，但基質(zhì)標樣中目標物的響應(yīng)值遠遠小于溶劑標樣中目標物的相應(yīng)值，且重復(fù)檢測后響應(yīng)值衰減很快。[M＋NH4]＋模式的靈敏度高，樣品基質(zhì)的離子抑制較小。選擇加入5 mmol/L乙酸銨可以提高離子化效率，增強穩(wěn)定性。以分離時間為橫坐標，相對豐度為縱坐標，4 種驅(qū)蟲藥物在添加量為10 μg/kg的牛乳中的提取離子色譜圖如圖1所示。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

綜合考察甲醇和乙 腈的色譜分離效果和組分進入質(zhì)譜前的離子化效率。與甲醇相比，以乙腈作為流動相，色譜峰響應(yīng)值高，對稱性好，但離子化效率卻較低。結(jié)果表明，在乙腈中加入0.1%的甲酸，能有效促進化合物的電離，峰形較理想。

2.5 線性范圍與檢出限

用乙腈配制系列不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液，同時選取不含目標化合物的空白奶樣，按1.3.2節(jié)處理后配制成一系列同溶劑標樣質(zhì)量濃度相同的基質(zhì)標樣，以信噪比為3的條件下確定方法檢出限，以信噪比為10的條件下確定方法定量限。分別以標樣質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果表明，在5～100 ng/mL范圍內(nèi)，溶劑標樣和基質(zhì)標樣的標準曲線線性良好（R2＞0.996）。用基質(zhì)與溶劑標準曲線斜率的比值反映基質(zhì)效應(yīng)的強弱[22]，見表3。結(jié)果表明，牛乳對吡喹酮和阿維菌素的基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，吡喹酮表現(xiàn)為增強效應(yīng)，而阿維菌素則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。因此，本實驗選用基質(zhì)標準曲線進行校正，消除基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定牛乳中伊維菌素的最大殘留限量為10 μg/kg[23]，本方法對吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素的檢出限分別為1.0、2.5、2.5、2.5 μg/kg，因此，本方法完全滿足上述藥物的實際檢測要求。

表3 4 種驅(qū)蟲藥物的標準曲線、相關(guān)系數(shù)（R2）、斜率比值、檢出限與定量限TTaabbllee 33 SSttaannddard curves in matrix and solvent with correlation coefficient (R2) and slope ratio LODs and LOQs for 4 parasiticides

2.6 方法準確度和精密度

在空白樣品中添加不同量的混合標準溶液，相當(dāng)于5、10、20 μg/kg 3個添加量，每一個添加水平重復(fù)6 次，按照1.3.2節(jié)進行處理并測定。由表4可見，4 種驅(qū)蟲類藥物的平均回收率為76.4%～113.3%，相對標準偏差為2.4%～10.6%，符合多組分痕量殘留檢測的要求。

表4 樣品加標回收率及精密度（n==66）Table4 Recoveries(nn == 66))

2.7 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對采自貴州省規(guī)模養(yǎng)殖場的15 份牛乳樣品進行測定，僅1 份檢出多拉菌素（3.8 μg/kg，我國規(guī)定泌乳期禁用），而吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素均未檢出。

3 結(jié) 論

本實驗建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素和多拉菌素殘留的方法，并對提取劑、凈化方法、色譜條件和質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，最終建立了一種簡便、快速、準確的檢測方法，滿足牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素和多拉菌素殘留的測定。

[1] 張文娟, 連庚寅, 郭曉喜, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定10 種食品中的阿維菌素類藥物殘留[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(18): 226-231.

[2] 徐漢虹, 梁明龍, 胡林. 阿維菌素類藥物的研究進展[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 26(1): 1-6.

[3] 汪芳, 周緒正, 李冰, 等. 動物抗寄生蟲藥物的研究與應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2010, 40(7): 766-770.

[4] 陳小軍, 孫志良, 楊惠麟. 伊維菌素制劑在動物醫(yī)學(xué)中的研究進展[J].湖南畜牧獸醫(yī), 2005(1): 1-3.

[5] 潘保良, 汪明. 關(guān)注抗寄生蟲藥物在牛奶中的殘留[J]. 中國奶牛, 2010(8): 53-54.

[6] 韓榮偉, 王加啟, 鄭楠, 等. 牛奶質(zhì)量安全主要風(fēng)險因子分析Ⅲ: 獸藥殘留[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(4): 1-10.

[7] DURDEN D A. Positive and negative electrospray LC-MS-MS methods for quantitation of the antiparasitic endectocide drugs, abamectin, doramectin, emamectin, eprinomectin, ivermectin, moxidectin and selamectin in milk[J]. Journal of chromatography B, 2007, 850(1/2): 134-146.

[8] BYGOTT J M CHIODINI P L Praziquantel Neglected drug Ineffective treatment Or therapeutic choice in cystic hydatid disease?[J]. Acta Tropica′2009′111(2): 95-101.

[9] 胡晶, 胡悅君, 郭潤正, 等. 吡喹酮治療血吸蟲病的不良反應(yīng)及處理[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2013, 15(10): 111-112.

[10] 向純明. 吡喹酮治療血吸蟲病引起多種不良反應(yīng)1例報告[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2013, 8(5): 4-5.

[11] 葉秀娟, 李君榮. 不同驅(qū)蟲藥組合對奶牛體內(nèi)寄生蟲驅(qū)蟲效果試驗[J].中國奶牛, 2013(12): 50-51.

[12] 陳琳琳, 肖希龍, 郭召緒, 等. 伊維菌素和吡喹酮復(fù)方注射液在綿羊體內(nèi)的藥代動力學(xué)[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2011, 47(6): 73-76.

[13] 湯佳莘, 歐陽五慶, 吳小利. 復(fù)方伊維菌素和吡喹酮納米乳的制備與質(zhì)量評價[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2014, 42(2): 35-40.

[14] TANG Shusheng, CHEN Linlin, GUO Zhaoxu, et al. Pharmacokinetics of a new ivermectin/praziquantel oil suspension after intramuscular administration in pigs[J]. Veterinary Parasitology, 2012, 185: 229-235.

[15] 林峰, 吳映璇, 姚仰勛, 等. GB 29696—2013 牛奶中阿維菌素類藥物多殘留的測定: 高效液相色譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

[16] MARTINEZ VIDAL J L, FRENICH GARRIDO A, LUIZ-AGUILERA M M, et al. Development of fast screening methods for the analysis of veterinary drug residues in milk by liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 397: 2777-2790.

[17] BUTCHER P, MADEN K, WALKER S, et a1. Quantification of anthelmintic drug residues in milk and muscle tissues by liquid chromatography coupled to orbitrap and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2011, 85: 991-1000.

[18] 吳傳萬, 杜小鳳, 王偉中, 等. 阿維菌素光分解及其光穩(wěn)定劑的篩選[J].農(nóng)藥, 2006, 45(12): 828-833.

[19] 何紅梅, 趙華, 張春榮, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水稻基質(zhì)中阿維菌素殘留量[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(1): 140-144.

[20] 楊方, 楊守深, 林永輝, 等. 超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測茶葉中阿維菌素類藥物殘留[J]. 色譜, 2009, 27(2): 153-15.

[21] 高潔, 苗虹. 獸藥殘留檢測技術(shù)研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2013, 4(1): 11-17.

[22] 何紅梅, 趙華, 張春榮, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水稻基質(zhì)中阿維菌素殘留量[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(1): 140-144.

[23] 農(nóng)業(yè)部畜牧局. 農(nóng)業(yè)部公告第235號: 動物性食品中獸藥最高殘留限量[EB/OL]. (2008-03-04) [2014-07-11]. http://www.moa.gov.cn/ zwllm/nybz/200803/t20080304_1028649.htm.

Simultaneous Determination of 4 Parasiticide Residues in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HOU Gaicheng1′TAN Aijuan2′*′L Shiming3′JIN Xiaofeng4′ZHANG Jianyong4
(1. College of Pharmacy Guizhou University Guiyang 550025′China; 2. College of Life Science Guizhou University Guiyang 550025′China; 3. College of Animal Science Guizhou University Guiyang 550025′China; 4. Guizhou Province Institute of Veterinary Drugs Control Guiyang 550003′China)

A new multi-residue analytical method was developed for the simultaneous determination of residues of 4 parasiticides i.e praziquantel ivermectin abamectin and doramectin in milk by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). The samples were extracted with acetonitrile and then cleaned up with alkaline alumina column The target compounds were separated with UPLC ACQUITY BEH C18column The mobile phase A (acetonitrile plus 0.1% formic acid and the mobile phase B (0.1% formic acid plus 5 mmol/L ammonium acetate were used in a gradient elution program The target drugs were detected by electrospray ionization mass spectrometry in positive ion mode with multiple reaction monitoring The results showed good linear relationships in the range of 5-100 ng/mL and the correlation coefficients were all above 0.996. The average recoveries ranged from 76.4% to 113.3%′and the relative standard deviations (RSDs were in the range of 2.4%-10.6%. The limits of detection (LODs for praziquantel ivermectin abamectin and doramectin were 1.0′2.5′2.5′and 2.5 μg/kg respectively The method was simple rapid and accurate to measure the residues of these four parasiticides praziquantel ivermectin abamectin and doramectin in milk.

UPLC-MS-MS; praziquantel; avermectins; residue; milk

TS207.3

A

1002-6630（2015）06-0216-04

10.7506/spkx1002-6630-201506041

2014-05-30

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)課題（黔科合NZ字[2012]3011號）；貴陽市農(nóng)委科學(xué)技術(shù)計劃項目（筑科合（2009第12-1號））

侯改成（1987—），男，碩士研究生，研究方向為微生物活性物質(zhì)。E-mail：gaichenghou_123@126.com

*通信作者：譚艾娟（1963—），女，教授，研究方向為微生物與生化藥學(xué)。E-mail：ajtan@gzu.edu.cn