一株既產表面活性劑又高效降解石油烴菌株的鑒定及降解效果

劉虹，王航，汪雪格，劉娜*，溫鋼，付凈，翦英紅

1. 吉林化工學院資源與環境工程學院，吉林 吉林 132022；2. 吉林大學環境與資源學院，吉林 長春 130021；3. 松遼水環境科學研究所，吉林 長春 130021；4. 吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022

一株既產表面活性劑又高效降解石油烴菌株的鑒定及降解效果

劉虹1，王航2，汪雪格3，劉娜2*，溫鋼4，付凈1，翦英紅1

1. 吉林化工學院資源與環境工程學院，吉林 吉林 132022；2. 吉林大學環境與資源學院，吉林 長春 130021；3. 松遼水環境科學研究所，吉林 長春 130021；4. 吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022

在修復石油烴污染的環境時，多采用表面活性劑增強修復效果，而一些微生物既能降解石油烴，又能代謝分泌表面活性劑，從而促進油的乳化，提高油的分散程度，增大菌株和油珠的接觸面積，提高其對石油烴的降解，增強修復效果。該研究從石油污染土壤中篩選出一株既產生物表面活性劑又高效降解石油烴的菌株B-6。通過觀察形態特征、生理生化試驗及16S rDNA序列分析，對菌株進行鑒定。并研究了菌株產生物表面活性劑及降解石油烴的特性。實驗結果表明，B-6初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。菌株B-6的發酵液經粗提后，得到黃褐色粘稠狀生物表面活性劑粗品，其產量為2.19 g·L-1。紅外光譜分析表明，菌株B-6在代謝過程中能產生糖脂類生物表面活性物質。該菌株用于水中石油烴的降解，石油烴初始濃度為2 000 mg·L-1，120 r·min-1、30 ℃下振蕩培養5 d后，菌株對石油烴的降解率達99.13%。

產生物表面活性劑；石油烴；降解；鑒定

LIU Hong, WANG Hang, WANG Xuege, LIU Na, WEN Gang, FU Jing, JIAN Yinghong. Identification of A Surfactant-producing and Petroleum Hydrocarbon Degrading Strain and Its Degradation Efficiency [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(12): 2035-2039.

近年來，由于人類在進行石油開采、儲運和生產加工等過程中不可避免地造成的石油泄漏以及含油污水的不合理排放等，致使大量的石油烴進入環境，造成土壤和地下水污染（楊明星等，2011；Farhad et al.，2000），其污染量大且面廣，危害著人類的健康，給生態環境也造成了很大的危害（程金香等，2004；陸秀君等，2003）。在石油烴污染環境的修復技術中，微生物修復技術由于清潔、投資低和效益高等優點受到重視（黃藝等，2009）。

目前，國內外已有大量關于石油烴微生物降解方面的研究報道。根據微生物在代謝石油烴過程中是否分泌生物表面活性劑，可將其分為兩大類：產生物表面活性劑菌株和不產生物表面活性劑菌株。有研究表明在石油泄漏污染場地，大部分石油烴吸附于土壤或其他介質上，或由于毛細力作用被包裹在介質孔隙中（Rober et al.，2006）。因此，在修復石油烴污染環境時，多采用表面活性劑增強修復效果（馬玉新等，2005）。而生物表面活性劑是帶有親水及親脂基團的兩性化合物（丁立孝等，2003），具有增加有機污染物的溶解性、降低表面張力和臨界膠束濃度、增加脂溶性污染物的生物可利用性（Banat，1995；劉桂萍等，2011；趙輝等，2010）等優點。目前對生物表面活性劑的研究，主要集中在產生物表面活性劑菌株的篩選（Albahry et al.，2012），而研究既產表面活性劑又具有降解石油烴能力的菌株的報道較為少見。曾有研究粘質沙雷氏菌Serratia marcescens、居植物柔武氏菌Raoultella planticola、克雷伯氏菌Klebsiella variicola和蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus產物性質及降解性能的報道（花莉等，2013）。本文從石油污染土壤中篩選出一株既產生物表面活性劑又高效降解石油烴的菌株，對其產生的生物表面活性劑進行分析，并研究了菌株對石油烴的降解率效果，為石油烴污染的微生物修復提供基礎理論和數據支持。

1　材料與儀器設備

1.1實驗菌株

菌株來源：來自松原油田被石油污染的土壤表層，經富集篩選得到，于冰箱4 ℃保存備用。

1.2主要儀器設備

QBZY全自動表面張力儀（上海方瑞）、GC-2014氣相色譜儀（日本島津）、HZQ-QX全溫振蕩器（哈爾濱東聯）、JMS-6700F場發射掃描儀、PTC-200型PCR儀（美國）、紅外光譜儀等。

1.3培養基

發酵培養基：(NH4)2SO410.0 g，KCl 1.1 g，KH2PO43.4 g，K2HPO44.4 g，MgSO40.5 g，酵母膏0.5 g，微量元素溶液 5.0 mL，菜油 20 mL，pH 7.2～7.4，去離子水1 L，分別在錐形瓶中加入100 mL，密封，濕熱滅菌20 min，溫度為121 ℃。其中，微量元素溶液：ZnSO40.29 g，CaCl20.24 g，CuSO40.25 g，MgSO40.17 g，去離子水1 L。

無機鹽液體培養基（單位：mg·L）：（NH4）2SO42000，K2HPO41550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，FeSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2。

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.2。

磷酸鹽緩沖液（0.2 mol·L-1，pH值7.0）：39 mL 0.2 mol·L-1NaH2PO4·2H2O溶液與61 mL 0.2 mol·L-1Na2HPO4·12H2O溶液混勻即得。

1.4樣品總石油烴（Total petroleum hydrocarbons，簡稱TPH）測試分析方法

色譜條件：注入口SPL1；注入方式：切片；溫度：280.0 ℃；載氣：氮氣·空氣；流量控制方式：壓力；壓力：59.5 kpa；流量總量：37.7 mL·min-1；柱箱流量：1.65 mL·min-1；線速度：30.9 cm·s-1；清洗流量：3.0 mL·min-1；分流比：20.0；高壓力注入：關閉；載氣保存：關閉；分流器定位：關閉。柱箱的初始溫度：80.0 ℃；平衡時間：3.0 min；總程序時間：31.50 min。柱箱信息包括柱箱名：Rtx-1；序列號：10124；薄膜厚度：0.25 mm；柱箱長度：30.0 m；內徑：0.32 mm ID；柱箱最大溫度：330 ℃。檢測器通道為DFID1，溫度：290.0 ℃；信號采集：是；采樣速率：40 ms；停止時間：31.00 min；延遲時間：0.00 min；極性：+。進樣體積：1.0 μL。

2　實驗方法

2.1菌株的鑒定

（1）菌株的形態觀察

取菌株用LB液體培養基培養至對數期，分別取10 mL培養液于離心管中，于4000 r·min-1離心10 min，沉淀用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖液中。各菌株采用JMS-6700F場發射掃描儀進行電子顯微鏡掃描成像，觀察菌株大小及形態。

（2）菌株生理生化實驗

按（包木太等，2013）進行生理生化實驗。

（3）16S rDNA的擴增與測序

16S rDNA基因的 PCR擴增引物包括上游引物：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；下游引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL反應液與1 μL 6×上樣緩沖液混合，在1%的瓊脂糖凝膠中，于150 V電壓下電泳檢測。

引物合成及 PCR產物測序由上海生工生物工程技術有限公司完成。

2.2生物表面活性劑的提取及初步鑒定

（1）生物表面活性劑的提取

將發酵液于 8000 rpm、4 ℃條件下離心 20 min，重復兩次后除去菌體；上清液用 12 mol·L-1的HCl調節pH至 2.0，出現絮狀沉淀，4 ℃靜置過夜；在10000 rpm、4 ℃條件下離心30 min，倒掉上清液，沉淀用少量的pH 2.0的HCl溶液全部洗下，再用1 mol·L-1的NaOH調節pH至 7.0，冷凍干燥，即得到表面活性劑粗品。

（2）生物表面活性劑的紅外掃描（張翠竹等，2000）

取生物表面活性劑適量，KBr壓片，用紅外光譜儀進行紅外分析。

2.3菌株石油烴降解效率

于6個100 mL的錐形瓶中分別加入50 mL的無機鹽培養液、100 mg 0#柴油。其中1個樣品不加菌作為空白對照，其余5個樣品分別加入5 mL降解菌培養液（OD 600約為0.6），于120 rpm、30 ℃下振蕩培養5 d。每隔1天取樣，加入10 mL正己烷進行萃取。萃取后的有機相經無水硫酸鈉干燥后，用GC測定總石油烴（TPH）殘留量，計算石油烴的降解率。石油烴降解率計算公式如下：

3　結果與討論

3.1菌體形態及生理生化特性

經電鏡掃描，菌株B-6形態圖見圖1。生理生化實驗結果見表1。由圖1可知，菌株B-6為短桿菌，長度約為1.0 μm。

圖1　B-6的掃描電鏡照片Fig. 1 SEM photo of B-6

表1　菌株B-6的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain B-6

3.2菌株分子鑒定

3.2.116SrDNA片段測序結果

菌株B-6通過PCR反應得到長1458 bp的片段，其測序結果如下。PCR擴增產物電泳圖如圖2。

如圖2所示，菌株B-6的16S rDNA的擴增產物大小約1500 bp，測序結果表明其16S rDNA序列全長為1422 bp。

圖2　菌株B-6的16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis result of 16S rDNA PCR amplification production from strain B-6

3.2.2菌株16S rDNA系統發育分析

將菌株16S rDNA序列輸入GenBank數據庫中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），以BLAST軟件進行序列同源性比較，選擇同源性大于 98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0軟件對B-6進行系統發育分析，用Neighbor-joining法構建系統發育樹，500次重復檢測，計算自引導值（Bootstrap）以估計系統進化樹的置信度。結果如圖3所示。

由圖 3可知：B-6菌與 Pseudomonas otitidis（MCC10330）進化距離較近，并結合生理生化特性，判定 B-6菌株在分類學上屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。已有的研究表明，假單胞菌既可產生物表面活性劑，又具有降解石油烴的特性，在石油烴污染環境修復中具有潛在的應用價值（章慧等，2013）。

3.3生物表面活性劑的鑒定

3.3.1表面活性物質

從B-6菌株發酵液提取的生物表面活性劑粗品為黃褐色粘稠狀固體（如圖 4所示），具有極大粘性并具有良好的水溶性，產量為2.19 g·L-1。

3.3.2紅外光譜

菌株B-6的粗產品干燥后經KBr壓片做FT-IR分析，結果見圖5。

圖5中的吸收帶表明該分子中存在大量－OH、－CH2、C=C不飽和雙鍵、C=O和C－O－C鍵，表明分子中存在環狀內酯結構和糖苷鍵；羰基的存在，表明該生物表面活性劑為不飽和脂肪和芳香類化合物；存在酮和羰基之間的化合物吸收帶。因此，初步斷定該生物表面活性劑為不飽和糖脂類物質。

3.4菌株對石油烴的降解效果

由圖 6可以看出，B-6菌株對石油烴的降解率在初始的2 d增加較快，3 d后降解較為緩慢。降解 5 d后，B-6菌株對石油烴的降解率達到99.13%。

圖3　菌株B-6基于16S rDNA的系統發育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of strain B-17 based on 16S rDNA gene sequences

圖4　生物表面活性劑粗品Fig. 4 Biosurfactant crude products

圖5　生物表面活性劑的紅外吸收光譜Fig. 5 Results of biosurfactant analysis by FT-IR spectrogram

圖6　菌株對石油烴的降解率曲線Fig. 6 Petroleum hydrocarbon degradation rate curve of the strain

4　結論

從石油污染土壤中分離出的B-6菌株經形態特征、生理生化試驗及16S rDNA序列分析，鑒定為Pseudomonas sp.。其所產的生物表面活性劑經紅外光譜分析為糖脂類生物表面活性劑。菌株對石油烴的降解率在5 d后達到99.13%。在實際石油烴污染環境的修復中，可以通過添加該菌種降解石油烴，同時該菌代謝產生的表面活性劑可增強石油烴污染的修復效果。

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Identification of A Surfactant-producing and Petroleum Hydrocarbon Degrading Strain and Its Degradation Efficiency

LIU Hong1, WANG Hang2, WANG Xuege3, LIU Na2*, WEN Gang4, FU Jing1, JIAN Yinghong1
1. School of Resources and Environment Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China; 2. College of Environment and Resources, Jilin University, Changchun, 130021, China; 3. Songliao institute of water environmental science, Changchun 130021, China; 4. College of Biology and Food Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China

A great amount of petroleum hydrocarbons inevitably enter the environment as a result of oil leakage in oil exploitation, transport, production and processing, which lead to soil and groundwater contamination. In oil contaminated sites, most of petroleum hydrocarbons are adsorbed on soil or other medium and wrapped in pore medium by capillary force. Surfactant can be employed to enhance efficiency in remediation of petroleum hydrocarbons pollution. There exists biosurfactant- producing microbes which are capable of degrading petroleum hydrocarbons and surfactants can be produced in its metabolic, which promote the oil emulsion, improve the dispersion degree of oil, increase contact between strain and oil droplet, improve the microbial degradation of petroleum hydrocarbons and strengthen the remediation effect. A biosurfactant-producing stain designated as B-6 which was capable of degrading petroleum hydrocarbons was screened out from crude oil-contaminated soil. The strain was identified based on morphological characteristics, physiological and biochemical test and 16s rDNA sequence analysis. The characteristics of surfactant producing and petroleum hydrocarbons biodegradation were studied. The results showed that the strain was preliminary identified as Pseudomonas sp. and the crude biosurfactant produced was tan, viscous solid with yield 2.19 g·L-1. Infrared spectrum analysis indicated that glycolipid biosufactant was produced by strain B-6 in its metabolic process. In biodegradation of petroleum hydrocarbons, it revealed that petroleum hydrocarbon degradation rate of the strain was up to 99.13% after the strain incubated in a rotary shaker at 30 ℃ and 120 r·min-1for 5 days and initial concentration of petroleum hydrocarbons was 2 000 mg·L-1.

biosurfactant production; petroleum hydrocarbons; degradation; identification.

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.12.017

X172

A

1674-5906（2015）12-2035-05

國家自然科學基金項目（41302185）

劉虹（1980年生），女，副教授，博士，主要從事環境污染生物修復研究。E-mail: wo_zhao_lh@163.com *通信作者：劉娜（1977年生），女，教授，博士生導師，主要從事環境污染生物修復研究。E-mail: liuna@jlu.edu.cn

2015-11-05

引用格式：劉虹, 王航, 汪雪格, 劉娜, 溫鋼, 付凈, 翦英紅. 一株既產表面活性劑又高效降解石油烴菌株的鑒定及降解效果[J]. 生態環境學報, 2015, 24(12): 2035-2039.