重組人RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節物12-Fc融合蛋白載體的構建和表達*

傅行禮，鞠愛萍，馬小蘭，葉軍

（1.江蘇大學醫學部，江蘇 鎮江 212001；2.山東省鄒城市人民醫院，山東 鄒城 273500；3.江蘇省泰州市中醫院，江蘇 泰州 225300；4.江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300）

·論著·

重組人RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節物12-Fc融合蛋白載體的構建和表達*

傅行禮1，鞠愛萍2，馬小蘭3，葉軍4

（1.江蘇大學醫學部，江蘇 鎮江 212001；2.山東省鄒城市人民醫院，山東 鄒城 273500；3.江蘇省泰州市中醫院，江蘇 泰州 225300；4.江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300）

目的用pIRES2-EGFP-Fc載體構建重組人RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節物12（MED12）-Fc真核表達質粒，轉染中國倉鼠卵巢（CHO）細胞表達MED12-Fc融合蛋白，純化和鑒定MED12-Fc。方法根據GenBank中的序列信息，從基因組上擴增出人MED12基因第2、3和4外顯子，并通過Overlap聚合酶鏈反應（PCR）拼接獲得目的基因片段，以pIRES2-EGFP-Fc真核表達質粒為載體，構建重組人MED12-Fc真核表達質粒。使用脂質體瞬時轉染293T細胞，48 h收集上清液，用酶聯免疫吸附法（ELISA）鑒定質粒的表達能力。表達質粒電轉CHO細胞，通過G418抗性篩選及流式細胞儀熒光篩選，獲得高表達的穩定細胞株。使用穩定細胞株培養表達人MED12-Fc融合蛋白，收集上清液，用Proein A親和純化柱純化蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）檢測蛋白質分子量。結果通過DNA測序和瞬時轉染表達鑒定，證實MED12第2、3和4外顯子基因序列正確，成功獲得重組人MED12-Fc真核表達質粒。通過電轉化、G418及流式細胞儀熒光篩選，獲得高表達重組人MED12-Fc的穩定表達細胞株。通過細胞培養，親和層析純化，獲得高純度的重組人MED12-Fc融合蛋白。結論成功構建MED12-Fc融合蛋白的表達載體，獲得高純度的重組人MED12-Fc融合蛋白，為進一步研究MED12蛋白功能奠定基礎。

RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節物12；融合蛋白；表達載體

RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節物12（mediator of RNA polymeraseⅡtranscription 12，MED12）是中介體復合物（mediator complex）的一個亞基，在真核細胞中調節轉錄，并參與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、核受體（nuclear receptor，NR）和Wnt信號通路[1-2]。MED12分子的進化保守區域具有重要的轉錄調控功能，但是MED12基因序列上也存在突變熱點，該位點的突變會對MED12蛋白的功能產生影響，最終導致某些疾病的發生。本實驗將MED12第2、3和4外顯子通過Overlap聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）拼接獲得目的基因片段，以pIRES2-EGFP-Fc真核表達質粒為載體，構建重組人MED12-Fc真核表達質粒，將其轉染中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞進行穩定表達，獲得MED12-Fc融合蛋白，為進一步開展MED12蛋白功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1載體與細胞pIRES2-EGFP-Fc真核表達載體由本實驗室構建和保存，該載體含有hCMV啟動子、高效信號肽序列，以及人IgG1從鉸鏈區到CH3的Fc片段，可引導外源蛋白融合分泌表達。同時，該載體中含有Neo篩選基因、內核糖體進入序列（internal ribosome entry site，IRES）雙表達元件、增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent pro tein，EGFP），可進行G418篩選及熒光檢測和篩選，人腎上皮293T細胞、CHO細胞由本實驗室保存。

1.1.2儀器與試劑臺式離心機購自德國Ependorf公司，凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司，PCR儀購自美國Application Binary Interface公司，24孔細胞培養板、酶標版購自美國康寧公司，酶標儀購自美國Molecular Devices公司，電穿孔儀、電擊杯購自美國Bio-Rad公司，PCR產物回收試劑盒、質粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、組織基因組抽提試劑盒購自美國Axygen公司，HindⅢ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶等分子生物學產品購自美國Fermentas公司，DH5a感受態細胞、溶菌肉湯（luria-bertani，LB）培養基、LB培養平板等均由本實驗室制作，所用基礎試劑包括蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、卡那霉素、G418、西班牙瓊脂糖等購自上海生工生物工程股份有限公司，高效轉染試劑LipofectamineTM2000 CD、無動物來源組分的培養液Optipro無血清培養基（serum free medium，SFM）、Hybridoma-SFM、胰蛋白酶等細胞培養試劑購自美國Invitrogen公司，無熱源內毒素抽提試劑盒、內毒素檢測試劑盒（美洲鱟試劑）、鄰苯二胺購自美國Sigma公司，MED12單抗購自美國Novacell公司，人IgG1酶聯免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）Kit（Cat#ab100548）購自美國Abcam公司。

1.1.3基因序列與引物設計GenBank中查詢MED12基因信息，設計擴增第2、3和4外顯子的Overlap PCR引物。使用Primer Premier 5軟件，設計Overlap PCR引物，并添加克隆位點。引物由南京金思瑞生物科技有限公司合成。MED12-正向引物1：CTCTAAAGCTTCGATGAACTGACGGCCTTGAA，MED12-反向引物1：AGTTGGAACTGATCTTGGCAG GATTGAAGCTGA；MED12-正向引物2：ATCCTGCC AAGATCAGTTCCAACTTCAGCAG，MED12-反向引物2：TGAAAATGGGGACCTTTTTGGCTAGTTGCGTGA；MED12-正向引物3：TAGCCAAAAAGGTCCCCA TTTTCAGTAAGAAG，MED12-反向引物3：CTCTGG GATCCATGAAAGGGTCAACATGTCT。

1.2方法

1.2.1MED12基因第2、3和4外顯子PCR擴增采集健康人抗凝血1 ml，使用美國Axygen公司的血液基因組抽提試劑盒，按照說明書操作步驟對樣本進行基因組抽提。在50μl的PCR反應體系中，分別加基因組模板5μl、雙蒸水37μl、10×pfu Buffer 5μl、2.5 mmol dNTP 1μl、正向引物（50 pmol）0.5μl、反向引物（50 pmol）0.5μl、pfu高保真DNA聚合酶1μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環，72℃繼續延伸5 min。以從基因組上擴增獲得的第2、3和4外顯子PCR產物為模板（混合），Overlap PCR擴增MED12第2、3和4外顯子全長。

1.2.2MED12-Fc真核表達載體的構建①載體與PCR產物的酶切：根據美國Fermentas公司提供的雙酶切條件，分別對pIRES2-EGFP-Fc載體、MED12-PCR產物進行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，37℃水浴反應2 h。使用美國Axygen公司的DNA回收試劑盒，對酶切載體和PCR產物做純化回收。②載體與基因的連接、轉化DH5a：根據美國Fermentas公司T4 DNA連接酶說明書配置如下：10×T4 DNA連接酶Buffer 2μl、載體2μl、片段5μl、T4 DNA連接酶2μl，用雙蒸水補足至20μl。將反應液混勻后22℃連接30 min，取10μl連接反應液轉入DH5a感受態細胞中，冰浴10 min。42℃熱激90 s，再冰浴2 min，加入700μl已滅菌的LB培養基。37℃震蕩培養30 min后，均勻涂布含有卡那霉素的LB培養平板上，37℃培養過夜。③MED12-Fc陽性克隆的篩選和鑒定：挑取單菌落，用引物MED12-F1/MED12-R3進行菌落PCR擴增。然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出陽性克隆。將陽性克隆菌液擴大培養，質粒小量抽提試劑盒提取質粒。抽提好的陽性克隆質粒送南京金斯瑞生物科技公司測序，進行序列比對。

1.2.3瞬時轉染驗證MED12-Fc真核表達載體的表達①待轉染細胞預處理：用Hybridoma-SFM培養和傳代293T細胞，將處于對數生長期的293T細胞用胰酶消化后稀釋至4×105個/ml，鋪于24孔細胞培養板，每孔500μl。37℃培養約1 d，當細胞貼壁面匯合至90%時進行轉染。②DNA預處理：使用Sigma公司的無熱源內毒素抽提試劑盒抽提MED12-Fc表達質粒，取1μg質粒加入50μl Optipro SFM混勻，將2μl LipofectamineTM2000 CD轉染試劑混勻后室溫孵育20min。③細胞轉染：將DNA-轉染試劑復合物50μl滴加至24孔板中，混勻后37℃培養箱培養48 h。④ELISA檢測培養上清液：取瞬轉培養上清液，用Abcam雙抗夾心法ELISA檢測試劑盒做檢測，鄰苯二胺顯色后酶標儀讀數。

1.2.4MED12-Fc穩定高表達細胞株的建立①CHO細胞預處理：用含10%血清的杜氏改良Eagle培養基（Dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture F-12，DMEM/F12）培養和傳代CHO細胞。將處于對數生長期的CHO細胞用胰蛋白酶消化后稀釋至2×106個/ml。②MED12-Fc表達質粒的酶切處理：取5μg MED12-Fc表達質粒，加3μlBstBⅠ限制性內切酶過夜。取100 ng酶切后的質粒瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切是否完全。③電轉化CHO細胞，G418結合流式細胞儀熒光篩選穩定高表達細胞株：取2μg酶切線性的質粒與50μl CHO細胞懸液混勻，加入2 mm電擊杯中，設定電穿孔儀電壓800 V，電容25μF，電擊時間10 ms，電穿2次。電穿后電擊杯在冰上靜置10 min，移液管轉移細胞至含10%血清的DMEM/F12培養液的10 cm培養皿。2 d后待細胞生長狀態恢復，用600μg/ml G418對陰性細胞進行殺滅。觀察細胞狀態，4 d換培養液1次，2周后用流式細胞儀分選出特別高熒光強度的細胞，并用極限稀釋法種入96孔培養板。最終通過ELISA檢測，篩選得到穩定的高表達細胞株。

1.2.5MED12-Fc融合蛋白的表達與純化①MED12-Fc融合蛋白穩定細胞株的培養：選用1L的滾瓶連續培養，24 h后開始收集培養上清液，更換培養液。②MED12-Fc融合蛋白的純化：將培養上清液用0.22μm濾膜過濾，濾液以1 ml/min的流速通過Protein A層析柱（購自美國通用電氣公司），1×磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）洗滌層析柱，甘氨酸（pH=2.5）洗脫融合蛋白，PBS（pH=7.4）透析得到純品融合蛋白。③MED12-Fc融合蛋白的檢測：取純品融合蛋白做十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。④蛋白質印跡實驗鑒定MED12-Fc融合蛋白：MED12-Fc融合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉凝膠上的蛋白至硝酸纖維膜上，牛血清白蛋白封閉膜，用堿性磷酸酶標記的特異性抗人IgG-Fc的單克隆抗體（美國Jackson公司）進行蛋白質印跡實驗。蛋白質印跡實驗的標準分子量蛋白購自南京金思瑞生物公司（貨號：M00124）。

2 結果

2.1MED12基因第2、3和4外顯子的PCR擴增

以健康人外周血基因組為模板，PCR擴增MED12基因第2、3和4外顯子分別為105、192和156 bp（見圖1）。以擴增的3個片段為模板，MED12-正向引物1、MED12-反向引物3為首尾引物，Overlap PCR擴增MED12第2、3、4外顯子全長453 bp（見圖2）。

圖1 MED12基因第2、3和4外顯子的PCR擴增

圖2 Overlap PCR擴增MED12基因第2、3和4外顯子全長

2.2陽性克隆的篩選和鑒定

挑取單菌落，用引物MED12-正向引物1/ MED12-反向引物3進行菌落PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳（見圖3）。抽提好的陽性克隆質粒送南京金斯瑞生物科技公司測序，經序列比對，序列完全正確，測序峰圖見圖4。最終，成功構建pIRES2-EGFP-Fc真核表達質粒為載體，得到重組人MED12-Fc真核表達質粒（見圖5）。

圖3 陽性克隆的篩選

圖4 MED12-Fc真核表達載體測序峰圖

2.3流式細胞儀熒光篩選穩定高表達細胞株

2周后用流式細胞儀分選出其中高熒光強度的細胞，進行培養。見圖6。

2.4瞬時轉染驗證MED12-Fc真核表達載體的表達

取瞬轉培養上清，按照Abcam ELISA雙抗夾心法檢測試劑盒說明書進行操作，經鄰苯二胺顯色后酶標儀讀數測定，構建的MED12-Fc真核表達載體具有很高的表達能力，表達量為7.5 mg/L。

圖5 pIRES2-EGFP-Fc載體重組人MED12-Fc真核表達質粒示意圖

圖6 流式細胞儀篩選穩定高表達細胞

2.5MED12-Fc融合蛋白的檢測

取純品融合蛋白做聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果顯示，未還原的融合蛋白分子量為60～70 kD，經過二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）還原后，分子量約為30～40 kD。綜合糖基化因素，與預測值相符。見圖7。

圖7 MED12-Fc融合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.6蛋白質印跡實驗鑒定MED12-Fc融合蛋白

蛋白質印跡實驗結果顯示，還原和未還原的融合蛋白都出現條帶，且分子量與預期相符。見圖8。

圖8 MED12-Fc融合蛋白的蛋白印跡實驗

3 討論

MED12在所有真核生物細胞中表達，哺乳動物中，MED12基因定位于X染色體上[3]。人的MED12基因由45個外顯子構成，跨度為25 kb并含有豐富的GC重復序列。MED12的轉錄活性與發育過程和組織分布相關。MED12由2 212個氨基酸組成，分為4個區域：①C-末端亮氨酸豐富的區域；②亮氨酸、絲氨酸豐富的區域（5’-LS）；③脯氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸豐富的區域（PQL）；④Opa區域。研究認為MED12基因的5’-LS和PQL區域序列高度一致，而Opa區域序列相似性較差。目前對5’-LS和PQL區域功能的研究尚不明確，該區可能參與介導MED12與中介體復合物的聯系；Opa區域則可能與Wnt信號通路的轉錄調控有關[1]。MED12在Wnt家族基因編碼的糖蛋白細胞周期、細胞極性和遷移中發揮重要作用[2]。

MED12可以與不同的因子相互作用，調節生物活性。轉錄因子Nanog對胚胎干細胞多能性的維持起關鍵作用，MED12通過對Nanog基因的表達調控，激活或抑制轉錄依賴于啟動子與細胞分化的狀態[4]。MED12還參與Wnt信號通路。MED12可以與Wnt通路中的中心分子β-catenin相互作用，實現對靶基因的轉錄調控。通路激活后，β-catenin從細胞質易位到細胞核，MED12與中介體復合作用，激活下游基因的表達。MED12的功能不僅限于細胞核，細胞質中MED12與轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）R2抑制糖基化的不成熟相關，降低細胞質中TGF-βR2的水平[5]。最近較多的臨床研究顯示，子宮平滑肌瘤、子宮間質腫瘤、前列腺癌中存在MED12基因突變[6-11]。PéROT等[12]報道，所有典型的平滑肌瘤中都有MED12基因蛋白表達，而40%非典型平滑肌瘤、50%惡性潛能未定的子宮平滑肌腫瘤和80%平滑肌肉瘤無MED12蛋白表達，推測MED12的存在與突變可能會抑制惡性腫瘤的發生。

本實驗將克隆的MED12基因第2、3、4外顯子片段與IgG的Fc片段連接起來。耦聯的IgG Fc片段不僅可以發揮生物學效應，如抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用、激活補體產生的細胞毒性作用，而且可以顯著延長蛋白的半衰期。其可方便地通過protein A或protein G純化，用抗人Fc片段抗體標記物可識別融合蛋白的Fc片段，從而鑒定融合蛋白識別的組織和細胞。目前有大量商品化的抗人IgG Fc二抗，融合蛋白中的Fc片段可使目的蛋白易于進行同位素標記和酶標記，從而進行檢測。

本實驗成功構建pIRES2-EGFP-Fc真核表達質粒為載體，構建重組人MED12-Fc真核表達質粒，轉染CHO細胞進行篩選，建立穩定表達細胞株。夾心法ELISA結果證實該融合蛋白在細胞培養上清中呈分泌性表達。SDS-PAGE檢測表明，融合蛋白的相對分子質量同預期結果一致。pIRES2-EGFP-Fc重組載體的構建及MED12-Fc融合蛋白的成功表達為下一步檢測MED12-Fc融合蛋白的功能奠定基礎。

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（申海菊 編輯）

Construction and expression of a recombinant fusion protein plasmid containing extracellular domain of human mediator of RNA polymeraseⅡtranscription 12 and Fc fragment*

Xing－li FU1,Ai－ping JU2,Xiao－lan MA3,Jun YE4
(1.Medical College,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212001,P.R.China;2.The People's Hospital of Zoucheng,Zoucheng,Shandong 273500,P.R.China;3.Hospital of Traditional Chinese Medicine of Taizhou City,Taizhou,Jiangsu 225300,P.R.China;4.The People's Hospital of Taizhou,Taizhou,Jiangsu 225300,P.R.China)

【Objective】To construct eukaryotic expression plasmid of recombinant human mediator of RNA polymeraseⅡtranscription 12(MED12)－Fc using the pIRES2－EGFP－Fc vector and express the fusion protein of MED12－Fc in CHO cells,finally to purify and characterize it.【Methods】According to the information in GenBank,the sequence of exons 2～4 of human MED12 gene was amplified from the genome.The target fragment was obtained by Overlap PCR and splicing and then inserted into the pIRES2－EGFP－Fc vector.Recombinant expression vector MED12－Fc was constructed and evaluated by DNA sequencing.The plas－mid of MED12－Fc was transiently transfected into 293T cells using lipofectin reagent for 48 h.Then,the supernatant was collected and detected with enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit.The expression plasmid was transfected into CHO cells by electroporation,and the positive clone with high expression of fusion protein was selected through G418 resistant selection and flow cytometric fluorescence screening.The fusion protein secreted from positive clone was purified by protein－A affinity chromatography.The purified product was analyzed by SDS－PAGE.【Results】DNA sequencing and expression of transient transfection indicated the sequence of exons 2～4 of MED12 gene was correct and MED12－Fc was successfully constructed. The positive clone with high－expression fusion protein was obtained by electroporation,G418 resistant selection and flow cytometric fluorescence screening.The high－purity fusion protein was obtained by cell culture and protein A affinity chromatography.【Conclusions】The eukaryotic expression vector MED12－Fc has been successfully constructed and the high－purity MED12－Fc fusion protein has been obtained,which lay a foundation for further exploration of biological activity of MED12 protein.

mediator of RNA polymeraseⅡtranscription(MED)12;fusion protein;eukaryotic expression vector

Q782

A

1005-8982（2015）32-0014-06

2015-07-13

江蘇省衛生廳面上項目（No：H201456）；泰州市社會發展項目（No：TS2013009）

葉軍，E-mail：yejun@gotofcm.com；Tel：13625171902