胸腔積液患者細胞DNA異倍體、microRNA-192及其相關因子對非小細胞肺癌的診斷意義*

劉崇梅，王彩霞，陳鳳，于惠芝，王婕，陽娟

（湖南省岳陽市二人民醫院1.病理科，2.腫瘤科，湖南 岳陽 414000）

·論著·

胸腔積液患者細胞DNA異倍體、microRNA-192及其相關因子對非小細胞肺癌的診斷意義*

劉崇梅1，王彩霞1，陳鳳1，于惠芝2，王婕1，陽娟1

（湖南省岳陽市二人民醫院1.病理科，2.腫瘤科，湖南 岳陽 414000）

目的探討聯合檢測胸腔積液細胞DNA異倍體、microRNA-192（miRNA-192）含量及其相關因子在肺癌臨床診斷中的應用價值，以期提高良、惡性胸腔積液的鑒別能力。方法應用受試者工作特性曲線（ROC）對61例肺癌及70例良性腫瘤患者的胸水細胞DNA異倍體、miRNA-192含量、血清人細胞角蛋白19片段抗原21-1（CYFRA21-1）、吸煙史及卡氏功能狀態量表（KPS量表）的檢測結果進行分析和評價。結果兩組患者臨床資料單因素分析顯示，吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細胞miRNA-192及胸水細胞DNA異倍體比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。胸水細胞miRNA-192診斷肺非小細胞癌（NSCLC）的曲線下面積（AUC）= 0.735、約登指數（YI）=0.408；胸水細胞DNA異倍體診斷NSCLC的AUC=0.806，YI=0.556；聯合吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1診斷NSCLC的AUC=0.839，YI=0.596。將胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體納入診斷體系，5項危險因素聯合診斷NSCLC的AUC=0.867，YI=0.628。結論吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細胞miRNA-192及胸水細胞DNA異倍體的聯合檢測有助于對良、惡性胸腔積液進行鑒別診斷，提升NSCLC的診斷價值。

胸腔積液；DNA異倍體；miRNA-192；非小細胞性肺癌

臨床上胸腔積液常見、多發，病因復雜多樣，可由胸膜、肺部多種疾病引發，如胸膜炎、肺結核、惡性腫瘤等。臨床上約5%～10%惡性胸腔積液患者的原發腫瘤病灶無法明確。近年來，腫瘤標志物的應用提高了肺癌的診斷率。但某些腫瘤標志物單項檢測的敏感性和特異性并不高。近年來，國內外學者開展多種腫瘤標志物的測定，以協助該病的診斷及療效觀察[1]。MicroRNA（miRNA）是19～22核苷酸大小的非編碼RNA，是內源性表觀基因表達的調控者，可能成為潛在的生物標記物。目前，檢測這些分子的手段包括實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）、基因芯片、原位雜交和基因測序[2]。本文探討胸腔積液細胞DNA異倍體聯合miRNA-192對肺非小細胞癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的診斷意義，并將上述指標與肺癌常見的危險因素，包括吸煙史、卡氏功能狀態量表（karnofsky perfomance status，KPS）、血清人細胞角蛋白19片段抗原21-1（serum cytokeratin 19 fragments，CYFRA21-1）等項目進行對比，探討聯合檢測在肺癌臨床診斷中的應用價值，以期提高良、惡性胸腔積液的鑒別能力。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集本院2013年9月-2014年7月肺癌合并胸腔積液61例住院患者的血清及胸水樣本。男性43例，女性18例；平均年齡53.8歲。其中肺鱗癌31例，腺癌20例，腺鱗癌3例，大細胞癌7例。同時采集70例良性腫瘤患者的血清及胸水樣本作為對照組。男性30例，女性40例；平均年齡54.4歲。所有診斷經組織學或細胞學證實。所有患者入院后登記一般情況、吸煙史。根據患者當前狀況完成KPS量表評分，該量表分為10級，閾值0～100分。

1.2檢測方法

1.2.1血清CYFRA21-1清晨空腹抽靜脈血，離心取上清液待測。采用電化學發光法檢測血清CYFRA21-1，使用Cobas E411免疫分析儀和配套試劑（德國Roche公司）質控進行檢測。

1.2.2細胞DNA定量分析所有Feulgen染色片經MotiCytometer全自動細胞圖像分析系統（廈門Motic公司）進行掃描處理。根據系統診斷軟件所做的細胞DNA異倍體分析結果，分為3種情況：①正常細胞的DNA指數（DNA index，DI）為1，即為二倍體細胞（diploid cell，2C），無異倍體細胞和異常細胞峰；②4C細胞數＞5%被檢測細胞總數，但無異倍體細胞診斷為增生；③有≥3個DI≥2.5的細胞或有異倍體細胞峰診斷為陽性。

1.2.3miRNA-192測定①抽取患者胸腔積液，常規留取胸水樣本50 ml置于肝素瓶中充分混勻。70μm尼龍篩網過濾至離心管，4℃、1 500 r/min離心10min，去除上清液。加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸制備細胞懸液，于-80℃冰箱冷凍保存。細胞懸液濃度調至1×106個/ml，置于-80℃冰箱冷凍保存，嚴格按照miRNA提取分離試劑（美國ABI公司）說明書提取胸腔積液中的miRNA，用核酸蛋白分析儀（美國Bio Rad公司）測定RNA的純度和濃度。②逆轉錄miRNA：引物購自美國ABI公司。取焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）16μl、提取的RNA 1μl、miRNA-192或U6的特異性引物3μl，70℃水浴5 min后立即取出置于冰水浴5 min。向每個逆轉錄體系中加入5×逆轉錄酶禽成髓細胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）緩沖液10μl、RNasin（40 u/μl）1μl、逆轉錄酶AMV（10 u/μl）1μl、三磷酸脫氧核糖核苷酸（de oxyribonucleoside-5'-triphosphate，dNTPs）（2.5mmol/L）4μl、DEPC 14μl，42℃反應60 min，95℃滅活5 min，反應產物置于-20℃冰箱冷凍保存。使用Applied Biosystems-7500 RT-PCR儀測定樣本中的miRNA-192，反應體系總體積25μl，具體反應體系組成如下：逆轉錄反應產物（待測樣品）或三蒸水（空白對照組）5μl、5×PCR反應緩沖液5μl、250 mmol氯化鎂MgCl20.5μl、10 mmol dNTPs 0.75μl、5 u/μl Taq聚合酶0.25μl，正、反向miRNA-192引物各0.5μl，然后用三蒸水補足至25μl[3]。反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃延伸1 min，共50個循環。每個循環結束時收集熒光，并按照每提高0.3℃收集1次熒光的方式做熔解曲線。PCR儀自動檢測熒光值，以20.56μg/ml的標準品濃度，光密度260（optical density 260，OD260）/OD280比值為2.18倍，稀釋107、106、105、104、103做標準曲線。③在RT-PCR實驗中，計算機自動輸出每個反應體系的擴增曲線、熔解曲線和CT值。以U6RNA作為內參，以N=2-ΔCt表示胸水miRNA相對表達量，其中ΔCt表示miRNA-192與內參U6RNA的Ct差。用分析軟件依據上述公式自動計算待測樣品miRNA-192的相對含量。

1.3統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，用逐步條件Logistic回歸模型進行多因素回歸分析，對單因素比較差異有統計學意義的危險因素進行校正，分析相關危險因素（自變量）與患者病因診斷（自變量）的相關性，計算回歸系數最大似然估計值（b）、最大似然估計值的標準誤[SE（b）]、Wald檢驗統計量值[Wald（χ2）]、比值比的估算值（OR）、比值比估算值的95%可信區間（OR 95%CI）。選用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評價檢測指標的診斷價值，計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）、曲線下面積的95%可信區間（AUC 95%CI），依照公式計算危險因素的約登指數（Youden index，YI）：YI=敏感性+特異性-1。設定AUC 0.5～0.7時診斷價值較低，AUC 0.7～0.9時診斷價值中等，AUC＞0.9時診斷價值較高，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組患者的臨床資料比較

單因素比較顯示，兩組患者吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細胞miRNA-192、胸水細胞DNA異倍體比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的臨床資料比較

2.2逐步條件Logistic回歸分析

根據臨床資料單因素分析結果，采取逐步引入法，以組別為因變量，以單因素比較差異有統計學意義的指標為自變量。采用逐步向前法建立Logistic回歸方程，變量引入水準設置為0.05，剔除水準設置為0.10。依照自變量作用的大小進行排序并依次引入Logistic回歸方程，直至作用無統計學意義為止，隨即擬合主效應模型，分析上述指標與病因診斷的相關性。結果顯示，吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細胞miRNA-192及胸水細胞DNA異倍體5個變量進入最終回歸模型。其中KPS量表為診斷NSCLC的保護因素，其余4項指標為診斷NSCLC的危險因素。最終回歸模型的變量及參數見表2。

表25 種因素的Logistic回歸分析

2.3各項危險因素對NSCLC的診斷價值

以敏感性為縱坐標，以誤診率即1-特異性為橫坐標，分別繪制不同危險因素的ROC曲線以驗證其診斷效能。

2.3.1胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體聯合診斷胸水細胞miRNA-192診斷NSCLC的AUC= 0.735[95%CI（0.623，0.773），P＜0.05]，YI=0.408。胸水細胞DNA異倍體診斷NSCLC的AUC=0.806[95%CI（0.736，0.835），P＜0.05]，YI=0.556。見圖1。

圖1 胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體診斷NSCLC的ROC曲線

2.3.2吸煙史、KPS量表及CYFRA21-1聯合診斷聯合吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1 3項指標診斷NSCLC的AUC=0.839[95%CI（0.789，0.871），P＜0.05]，YI=0.596。見圖2。

圖2 吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1聯合診斷NSCLC的ROC曲線

2.3.3吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細胞miRNA-192及胸水細胞DNA異倍體聯合診斷將5項因素聯合應用診斷NSCLC的AUC=0.870 [95%CI（0.802，0.910），P＜0.05]，YI=0.628。各項危險因素的ROC曲線相關指標見表3和圖3。

表3 各項危險因素的ROC曲線相關指標

圖3 吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細胞miRNA-192及胸水細胞DNA異倍體聯合診斷NSCLC的ROC曲線

3 討論

研究資料顯示，約50%肺癌患者在疾病過程中出現胸腔積液，臨床上常用生物化學常規、脫落細胞學及腫瘤標志蛋白等方法鑒別良、惡性腫瘤，并盡早排除惡性胸腔積液[4]。脫落細胞學檢查尋找惡性細胞是目前臨床上診斷惡性胸腔積液的金標準，文獻報道其敏感性局限于70%左右。胸腔積液中常用的具有診斷意義的腫瘤標志蛋白有癌胚抗原、糖類抗原153（carbohydrate antigen-153，CA-153）、CA-199、CA-125、CA-724及CYFRA21-1[5]，其可能有助于診斷惡性胸腔積液，但特異性較差。近來DNA定量、游離mRNA的表達水平也被用于惡性胸腔積液的診斷研究，由于其對腫瘤類型診斷的精確性欠佳，臨床上尚未廣泛應用。因此，尋找胸腔積液中穩定存在、對患者創傷小、特異性高、可重復性高、出現較早的標志物對良、惡性腫瘤的鑒別意義重大。不僅有助于盡早確診惡性胸腔積液，而且有助于臨床上對惡性胸腔積液患者盡早實施最佳治療方案，減輕患者病痛[6]。

近年來，臨床上應用細胞DNA定量分析新方法鑒別惡性與炎性胸、腹水。其與細胞學診斷比較，敏感性高；與細胞形態學檢查相結合，可避免漏診，為臨床提供更明確的診治依據。本實驗中肺癌患者胸水細胞DNA異倍體的Logistic回歸分析顯示，其診斷NSCLC的AUC=0.806，說明該因素具有良好的診斷價值。XIE等[7]首次證明胸腔積液中游離miRNA可作為鑒別良、惡性胸腔積液的潛在指標，由此推測胸腔積液中miRNA的表達量可以作為良、惡性胸腔積液的鑒別指標。HAN等[8]利用RT-PCR檢測良性胸腔積液及肺腺癌相關胸腔積液中miRNA的表達含量，發現miR-198有可能作為區分肺腺癌惡性胸腔積液及良性胸腔積液的鑒別指標。本研究發現，惡性胸腔積液中miRNA-192的表達明顯高于對照組。ROC曲線分析提示，胸水細胞miRNA-192診斷NSCLC的AUC=0.735。Logistic回歸分析表明，miRNA-192的表達水平可以作為良、惡性胸腔積液的鑒別指標。

近年來研究顯示，聯合檢測腫瘤標志物對肺癌診斷有較好的應用價值，運用Logistic回歸分析和ROC曲線綜合分析可提高肺癌診斷的準確性[9]。本實驗就NSCLC患者的胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體與其他危險因素的相關性進行研究。多因素Logistic回歸分析表明，吸煙史、胸水細胞DNA異倍體陽性、KPS量表評分降低、CYFRA21-1及胸水細胞miRNA-192含量升高為診斷NSCLC的的獨立敏感因素。通過繪制上述敏感因素的ROC曲線顯示，胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體的AUC分別為0.735和0.806，說明這兩項敏感因素對NSCLC具有良好的診斷價值。此外，聯合吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1 3項指標診斷NSCLC的AUC=0.839，YI=0.596；在該基礎上加入胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體聯合診斷，5項敏感指標的AUC=0.870，YI=0.6281，較加入前明顯升高，進一步體現胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體對NSCLC的診斷價值。

綜上所述，胸水細胞miRNA-192和DNA異倍體是NSCLC的獨立敏感因素，單項檢測指標已具有良好的診斷價值。其與吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1聯合檢測有助于對良、惡性胸腔積液進行鑒別診斷，增加NSCLC的診斷價值。

[1]HUANG WW,TSAO SM,LAI CL,et al.Diagnostic value of Her-2/neu,Cyfra 21-1,and carcinoembryonic antigen levels in malignant pleural effusions of lung adenocarcinoma[J].Pathology, 2010,42(3):224-228.

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[5]陽娟,劉崇梅,王彩霞.微小RNAs在良惡性胸腔積液中的研究進展[J].腫瘤防治研究,2015,42(4):399-402.

[6]SHE J,YANG P,HONG Q,et al.Lung cancer in china:challenges and interventions[J].Chest,2013,143(11):1117-1126.

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（童穎丹 編輯）

Combined detection of pleural effusion cell DNA aneuploidy and microRNA-192 and its related factors in diagnosis of non-small cell lung cancer*

Chong－mei LIU1,Cai－xia WANG1,Feng CHENG1,Hui－zhi YU2,Jie WANG1,Juang YANG1
(1.Department of Pathology,2.Department of Oncology,the Second People's Hospital of Yueyang,Yueyang,Hunan 414000,P.R.China)

【Objective】To study the diagnostic value of combined detection of pleural effusion cell DNA aneuploidy and the content of microRNA－192(miRNA－192)and its related factors so as to improve the ability of differentiating benign and malignant pleural effusion.【Methods】The smoking history,Karnofsky performance status(KPS)scale,serum cytokeratin 19 fragments(CYFRA21－1),pleural effusion cell miRNA－192 and DNA aneuploidy of 61 patients with non－small cell lung cancer(NSCLC)and 70 patients with benign lung disease control were detected and evaluated by ROC curve.【Results】The univariate analysis of clinical information of the two groups of patients showed that there were significant differences in smoking history,KPS scale,CYFRA21－1,pleural effusion cell DNA aneuploidy and miRNA－192(P＜0.05).In diagnosing NSCLC,AUC=0.735,Youden index(YI)=0.408 for pleural effusion cell miRNA－192;AUC= 0.806,YI=0.556 for pleural effusion cell DNA aneuploidy;and AUC=0.839,YI=0.596 for a combination of smoking history,KPSscaleandCYFRA21－1.WhenthepleuraleffusioncellmiRNA－192andDNA aneuploidy were included into the diagnostic system,AUC=0.867,YI=0.628 using the five risk factors forcombined diagnosis of NSCLC.【Conclusion】Combined detection of smoking history,KPS scale,CYFRA21-1, pleural effusion cell miRNA-192 and DNA aneuploidy is favorable for identifying benign and malignant pleural effusion,which is associated with a significantly increased diagnostic value of NSCLC.

pleural effusion;DNA aneuploidy;microRNA-192;non-small cell lung cancer

R734.2

A

1005-8982（2015）32-0026-05

2015-06-25

湖南省科技廳科技資助項目（No：2014SK3144）