絲氨酸蛋白酶抑制因子基因檢測在乳腺癌骨髓微轉移診斷中的作用*

吳芳蘭，范先成，李倩，陳立華，李寧沙，徐丹，危德利

（湖南省長沙市第一醫院1.檢驗科，2.乳腺外科，湖南 長沙 410005）

·臨床論著·

絲氨酸蛋白酶抑制因子基因檢測在乳腺癌骨髓微轉移診斷中的作用*

吳芳蘭1，范先成2，李倩1，陳立華1，李寧沙1，徐丹1，危德利1

（湖南省長沙市第一醫院1.檢驗科，2.乳腺外科，湖南 長沙 410005）

目的探討乳腺癌患者骨髓中絲氨酸蛋白酶抑制因子（Maspin）mRNA的表達及臨床意義。方法用熒光定量聚合酶鏈反應（RTFQ-PCR）檢測58例乳腺癌、15例乳腺良性腫瘤及10例健康體檢者骨髓中的Maspin mRNA表達，并分析Maspin mRNA表達與臨床病理因素的相關性。結果58例乳腺癌患者中，20例Maspin mRNA陽性表達，陽性表達率為35.3%（20/58），顯著低于乳腺良性腫瘤患者（86.7%）和健康體檢者（90.0%）（P＜0.05）。Maspin mRNA陽性表達與乳腺癌臨床分期、腋窩淋巴結轉移呈負相關（P＜0.05）；與年齡、腫瘤大小、雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）表達無關（P＞0.05）。結論Maspin mRNA可作為檢測乳腺癌患者骨髓微轉移（BMM）的分子指標之一。BMM檢測可為乳腺癌患者的治療和預后判斷提供幫助。

乳腺癌；骨髓；微轉移

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，為女性最常見的死亡原因之一。在各種惡性腫瘤中，乳腺癌是治療效果比較好的一種，但總生存率仍不能令人滿意[1]。臨床現有的檢查，如腋窩淋巴結轉移狀態（axillary lymphnode state，ALNS）、原發灶大小、腫瘤組織學分級、激素受體狀況等尚不能準確地預測腫瘤的復發和轉移[2]。許多研究表明，乳腺癌是一個全身系統的疾病，即使早期乳腺癌，也會發生隱匿性轉移[3]。如果能在亞臨床階段檢測到微小轉移灶，則對疾病的分期、治療、預后有重要意義。

本實驗擬分析絲氨酸蛋白酶抑制因子（Maspin）基因檢測在乳腺癌骨髓微轉移（bone marrow micrometastasis，BMM）診斷中的作用，以指導臨床治療和預后評估。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2010年12月-2014年8月在湖南省長沙市第一醫院行手術治療的乳腺癌女性患者58例。中位年齡46歲。所有患者經病理檢查確診，術前未接受放射及化學治療，常規檢查血清鈣、堿性磷酸酶及肝、腎功能，行乳腺鉬靶照片、胸片、腹部、盆腔B超及全身發射型計算機斷層掃描（emission computed tomography，ECT），以排除遠處轉移。按照國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Contro，UICC）2010年腫瘤TNM分期標準：Ⅰ期12例，Ⅱ期29例，Ⅲ期17例。伴有腋窩淋巴結轉移35例，無腋窩淋巴結轉移23例。按照1982年WHO乳腺腫瘤組織學類型分類標準：浸潤性導管癌53例，浸潤性小葉癌3例，導管內癌2例。隨機選取乳腺良性腫瘤，并排除合并身體其他部位惡性腫瘤的患者15例。其中，纖維腺瘤14例，導管內乳頭狀瘤1例；年齡16～63歲，中位年齡34歲。健康者（單純乳腺增生）10例；年齡20～45歲，中位年齡35歲。以15例乳腺良性腫瘤及10例健康者骨髓標本為陰性對照組。本研究得到醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2儀器和試劑

ABI PRISM 7300熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）儀（美國Applied Biosystems公司），連續光譜熒光酶標儀（美國Thermo Electron Corporation公司），Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）置于4℃冰箱保存，One Step SYB Prime ScriptTMRT-PCR kitⅡ（大連寶生物工程有限公司）置于-20℃冰箱冷凍保存，PCR引物（大連寶生物工程有限公司）。

1.3研究方法

1.3.1骨髓取樣骨髓取樣采用三點取材法（雙側的髂嵴和胸骨），取乳腺癌患者及非乳腺癌患者骨髓血進行研究。

1.3.2RTFQ-PCRRTFQ-PCR檢測骨髓血中Maspin mRNA。①引物和探針。Maspin mRNA正向引物：5'-CTGACAACAGTGTGAACGACCAGA-3'，反向引物：5'-GACAACGTGGCCTCCATGTTCATC-3'，理論產物166 bp；以18 S rRNA作為內參照，正向引物：5'-ACTCAACACGGGAAACCTCA-3'，反向引物：5'-AACCAGACAAATCGCTCCAC-3'；Taqman熒光探針：5'-CATACCGTCAGTTCTACT-3'。以羧基熒光素作報告集團標記探針5'-，四甲基羅丹明為熒光淬滅集團標記探針3'-。②PCR條件。總RNA抽提后參照大連寶生物工程有限公司的One Step SYB Prime ScriptTMRT-PCR kitⅡ說明書進行逆轉錄反應，總體積20μl。擴增參數：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。反應結束后儀器自動計算樣本中的起始濃度（拷貝/ml）。③結果判斷。樣本檢測結果＜103拷貝/ml的檢測下限為Maspin mRNA低表達（陰性），≥103拷貝/ml為高表達（陽性）。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，并行χ2檢驗和Fisher確切概率法，Maspin mRNA與臨床病理特征的相關性選用多因素Logistic回歸模型分析，納入自變量用Enter法，P＜0.05為差異有統計學意義。

附圖骨髓標本Maspin mRNA熒光定量擴增圖

2 結果

2.1骨髓中Maspin mRNA的表達

本研究構建的RTFQ-PCR檢測Maspin mRNA方法特異性較好，熔解曲線未發現非特異性峰，實現定量擴增（見附圖）。58例乳腺癌患者骨髓標本中，20例出現Maspin mRNA陽性表達，陽性表達率為34.5%（20/58）。15例乳腺良性腫瘤患者及10例健康者骨髓標本中陽性表達率為86.7%（13/15）和90.0%（9/10），顯著高于乳腺癌患者（P=0.000）（見表1）。

表1 乳腺癌、良性乳腺腫瘤及健康體檢者骨髓中Maspin mRNA的表達例（%）

2.2Maspin mRNA在乳腺癌患者骨髓中的表達及與臨床病理特征的相關性

Maspin mRNA陽性表達與乳腺癌臨床分期、腋窩淋巴結轉移呈負相關（P＜0.05）；與年齡、腫瘤大小、雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）的表達無關（P＞0.05）。見表2。

表2 乳腺癌患者骨髓中Maspin mRNA表達與臨床病理特征的相關性例（%）

3 討論

微轉移是指采用常規的病理學方法在機體組織、體液及細胞移植物中難以檢測到的微量腫瘤細胞，而采用免疫細胞化學法和分子生物學方法可檢測到[4-5]。其中最為靈敏的是RTFQ-PCR，其在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過加入已知濃度的標準樣本繪制的標準曲線，推算出樣本中初始模板的濃度，可定性、定量地檢測微量的腫瘤細胞。目前的精度已達到107個細胞中即能找出1個腫瘤細胞。

通過檢測腫瘤的微轉移來監測腫瘤的發展趨勢，在腫瘤可能轉移的早期就進行干預，消滅潛在的微轉移灶，對提高腫瘤患者的總體療效和改善預后都有重大的意義。骨髓組織具有分子篩的作用，其血管內皮細胞含有許多腫瘤抗原的受體，能夠粘附腫瘤細胞使其滯留在骨髓組織。由于骨髓獨特的結構和血流特點，往往是腫瘤細胞血行轉移最早到達并聚集成灶的組織，因而骨髓微轉移的臨床研究已引起廣泛關注[6]。

骨髓是腫瘤細胞最易到達的部位，一旦出現就預示已發生遠處轉移。乳腺癌很易發生骨轉移，死于乳腺癌的患者尸檢中75%有骨轉移。淋巴結與骨髓轉移相互獨立，檢測淋巴結轉移陰性患者的骨髓微轉移有重要的意義。目前越來越多的資料表明，BMM與乳腺癌的生物學特性關系密切，BMM可以作為一個獨立的預后因素。乳腺癌表達某些特異性的標志物，為檢測骨髓微轉移提供可能[7]。多項研究證實，腋淋巴結轉移陰性患者中，骨髓微轉移陽性者預后差[8-9]。有研究檢測307例患者，81例骨髓微轉移陽性者26例復發，226例陰性者34例復發，骨髓微轉移陽性者無病生存期和生存率明顯下降[10]。BRAUN等[11]用抗細胞角蛋白單抗和免疫組織化學方法分別檢測150例淋巴結轉移陰性Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者的骨髓及淋巴結微轉移。結果發現，骨髓微轉移陽性率為29%（44/150），淋巴結轉移陽性率為9%（13/150），多因素分析證明，骨髓微轉移是獨立預后因素，建議以此作為分層因素，選取淋巴結轉移陰性患者進行術后化療。目前，國際上也正在進行這方面的隨機研究，以明確其相關性。骨髓微轉移有望成為腋窩淋巴結轉移陰性者術后化療的參考依據。

Maspin基因位于染色體18q21.3，其蛋白屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，卵清蛋白亞族，在腫瘤侵襲轉移中起重要作用[12]。LELE等[13]研究表明，Maspin在乳腺細胞表達。STATHOPOULOU等[14]用巢式逆轉錄聚合酶鏈反應技術對乳腺癌患者Maspin mRNA表達進行研究，認為Maspin mRNA僅在乳腺癌中表達且與細胞角蛋白19 mRNA、癌胚抗原mRNA有相對很高的特異性。近年有研究證明，Maspin mRNA可作為乳腺細胞的特異性標志物[15]，并可能成為乳腺癌治療的特異性靶標。

本研究結果表明，Maspin mRNA作為乳腺癌骨髓微轉移的一項分子檢測指標，能反映腫瘤細胞的全身播散狀況，可為判斷和動態監測病情、指導治療提供更準確的依據。骨髓中Maspin mRNA的存在能否作為乳腺癌的一項獨立預后指標，還有待于擴大樣本量和長期隨訪，收集大量詳實的臨床資料，進一步明確其應用價值。

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（申海菊 編輯）

Clinical significance of Maspin expression in bone marrow of breast cancer patients*

Fang－lan WU1,Xian－cheng FAN2,Qian LI1,Li－hua CHEN1, Ning－sha LI1,Dan XU1,De－li WEI1
(1.Department of Laboratory Science,2.Department of Breast Surgery,the First Hospital of Changsha,Changsha,Hunan 410005,P.R.China)

【Objective】To evaluate expression and clinical significance of the Maspin mRNA in bone marrow of breast cancer patients.【Methods】The expression of Maspin mRNA was detected by the real－time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTFQ－PCR)in the bone marrow aspiration from 58 breast cancer patients,with samples of 15 benign breast tumor and 10 healthy volunteers as contro1s.The possible correlation of Maspin mRNA expression with clinicopathologic parameters and related molecular markers were analyzed.【Results】The positive expression of Maspin mRNA was detected by RTFQ－PCR in 20 of the 58 patients with breast cancer.The positive rate was 34.5%,which was much lower thanthat in the patients with benign breast tumor(86.7%)and healthy volunteers(90.0%)(P＜0.05).Maspin mRNA expression was negatively correlated with clinical stage of breast cancer and axillary nodal involvement (P＜0.05),but was not related to age,tumor size,ER or PR status(P＞0.05).【Conclusions】Maspin mRNA may be used as a molecular marker for detection of bone marrow micro－metastasis(BMM)in patients with breast cancer.The results of detecting BMM may have an impact upon therapeutic recommendations and prognostic judgment in breast cancer patients.

breast cancer;bone marrow;micro－metastasis

R737.9

A

1005-8982（2015）32-0045-04

2015-02-15

湖南省科技計劃項目（No：2014FJ6050）