淺表血栓性靜脈炎管壁的細胞凋亡水平變化*

孫延平，吳洪娟，王磊，徐永波，唐金元，李坤，張晶晶，李虎，褚海波

（1.解放軍第89醫院普外中心，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫學院電鏡室，山東 濰坊 261042；3.濰坊醫學院研究生部，山東 濰坊 261042）

·臨床論著·

淺表血栓性靜脈炎管壁的細胞凋亡水平變化*

孫延平1，吳洪娟2，王磊3，徐永波1，唐金元1，李坤1，張晶晶1，李虎1，褚海波1

（1.解放軍第89醫院普外中心，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫學院電鏡室，山東 濰坊 261042；3.濰坊醫學院研究生部，山東 濰坊 261042）

目的檢測淺表血栓性靜脈炎管壁的細胞凋亡水平變化，探討細胞凋亡與靜脈管壁擴張的相關性。方法收集大隱靜脈曲張標本50例，其中淺表血栓性靜脈炎（血栓組）和單純靜脈曲張標本各25例（曲張組）。正常大隱靜脈標本15例（對照組）。采用末端標記法（TUNEL）、免疫熒光法、免疫組織化學法及電鏡，觀察細胞凋亡水平和超微結構變化。結果血栓組和曲張組管壁內膜和中膜凋亡細胞比率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；血栓組和曲張組管壁Bcl-xl陽性蛋白呈高表達，對照組管壁Bax陽性蛋白呈高表達。電鏡顯示，3組凋亡細胞形態學特征為線粒體嵴模糊、髓樣變、核染色質邊集。結論淺表血栓性靜脈炎和曲張靜脈通過內源性通道引發細胞凋亡調節異常，導致靜脈管壁擴張、增厚，推測其可能是靜脈曲張的發病機制之一。

淺表血栓性靜脈炎；靜脈曲張；隱靜脈；細胞凋亡

研究表明，下肢靜脈曲張管壁的改變先于瓣膜功能不全[1]。血管重塑理論的提出為研究靜脈曲張的病理發生、發展過程奠定理論基礎[2]。細胞凋亡參與曲張靜脈管壁重塑過程，兩者關系密切。檢測靜脈管壁細胞凋亡的方法諸多，如細胞核凋亡、細胞蛋白凋亡、酶的裂解及細胞超微結構變化，但曲張靜脈管壁細胞凋亡的結果尚未一致（增加或減少）[3-9]。本研究通過末端標記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）、免疫熒光染色法、Bax和Bcl-xl免疫組織化學法以及電鏡觀察、檢測靜脈曲張合并淺表血栓性靜脈炎、單純靜脈曲張以及正常大隱靜脈管壁細胞凋亡水平，探討細胞凋亡與靜脈管壁擴張的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2012年1月-2014年8月在本院行高位結扎剝脫加旋切治療的大隱靜脈曲張患者50例，分為淺表血栓性靜脈炎（血栓組）和單純靜脈曲張（曲張組），每組25例。其中，血栓組男性14例，女性11例；平均年齡35歲（28～45歲）。曲張組男性13例，女性12例；平均年齡36歲（27～46歲）。對照組為創傷行截肢術而大隱靜脈無損傷患者15例，男性9例，女性6例；平均年齡32歲（20～39歲）。術前50例患者經彩色多普勒超聲檢查，確診為原發性大隱靜脈曲張。血栓組為慢性血栓性靜脈炎（血栓形成時間＞30 d），按臨床、病因、解剖、病理生理分類為C2、C3。排除標準：下肢嚴重水腫，靜脈曲張伴皮膚改變，急性或亞急性血栓性靜脈炎（血栓形成時間＜14或30 d），非血栓性靜脈炎，動脈疾病及糖尿病患者。

1.2實驗方法與試劑

1.2.1標本收集和處理術中取膝關節下方大隱靜脈主干標本3～4 mm，10%福爾馬林溶液固定，常規脫水、包埋，4μm厚連續切片，備1張行蘇木精-伊紅染色。每個標本切片15份，每組5份分別行TUNEL染色、免疫熒光及免疫組織化學法檢測。獲取新鮮標本1 mm3，置3%戊二醛中固定24～48 h，常規脫水、包埋、烘干。采用超薄切片，厚70 nm，切片經水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液浸泡，雙蒸水清洗后放入枸櫞酸鉛溶液浸泡，最后用雙蒸水清洗干凈。采用日本日立公司生產的H-7500型透射電鏡觀察內皮和平滑肌細胞超微結構變化。

1.2.2TUNEL染色、免疫熒光及免疫組織化學法具體方法分別參考DUCASSE[9]和HEISING等[10]的研究。在400倍光鏡下對每張切片選取5個視野進行組織學分析。依據核染色強度、密度及染色質形態確定凋亡細胞的免疫組織化學表達。結果判斷由兩位病理醫師采用雙盲法讀取。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析處理圖像，計算每個高倍視野中管壁內膜和中膜凋亡的陽性細胞數。取同一標本5個視野中靜脈管壁內膜和中膜測量值凋亡的陽性細胞數之和，計算平均數，得出同一標本凋亡陽性細胞個數。細胞凋亡率（%）=每個高倍視野中凋亡細胞數/總細胞數×100%。羊血清由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，微波緩沖液自配，試劑由北京化工廠提供，Roche細胞凋亡試劑由瑞士羅氏生物科技公司提供，Bax和Bcl-xl試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用兩獨立樣本t檢驗，多組比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1靜脈管壁凋亡細胞分布

TUNEL法和免疫熒光法結果一致。血栓組和曲張組管壁內膜和中膜偶見單個的凋亡細胞，凋亡細胞在兩組的分布基本相同（見圖1A、B、D、E）；對照組靜脈管壁內膜和中膜可見較多凋亡細胞，以內膜和中膜內層明顯（見圖1C、F）。

2.2靜脈管壁凋亡細胞比率比較

血栓組和曲張組管壁內膜和中膜的凋亡細胞比率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；血栓組與曲張組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；3組內膜、中膜的凋亡細胞比率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見附表。

2.3靜脈管壁凋亡蛋白的陽性表達分布

血栓組與曲張組管壁內膜和中膜可見散在分布的Bax凋亡蛋白陽性表達，較多的Bcl-xl凋亡蛋白陽性表達（見圖2A、B、D、E）；對照組的內膜和中膜中，Bax和Bcl-xl凋亡蛋白陽性表達的分布與血栓組和曲張組相反（見圖2C、F）。

2.4靜脈管壁凋亡蛋白的陽性表達率比較

血栓組和曲張組管壁的內膜和中膜中，Bax凋亡蛋白陽性表達率減少，Bcl-xl凋亡蛋白陽性表達率增加；對照組管壁的內膜和中膜中，Bax凋亡蛋白陽性表達率增加，Bcl-xl凋亡蛋白陽性表達率減少。見圖3。

圖1 靜脈管壁TUNEL和免疫熒光染色法（×400，bar=20μm）

附表3組靜脈管壁內膜和中膜的凋亡細胞比率比較（%±s）

附表3組靜脈管壁內膜和中膜的凋亡細胞比率比較（%±s）

組別內膜中膜t值P值凋亡細胞比率凋亡細胞比率血栓組（n=25）2.60±0.872.80±0.880.660.515曲張組（n=25）2.80±1.222.88±1.050.250.860對照組（n=15）12.67±2.2911.60±1.501.510.143

圖2 靜脈管壁Bcl-xl和Bax免疫組織化學法（×400，bar=20μm）

2.5靜脈管壁凋亡細胞的超微結構變化

3組靜脈管壁內皮細胞（endothelial cells，ECs）和平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）凋亡形態學特征為線粒體模糊、嵴斷裂、髓樣變、粗面內質網增寬、脫顆粒、核染色質邊集（見圖4A～C和E～G）。正常形態學特征為線粒體、粗面內質網、核染色質正常（見圖4D、H）。

圖3 靜脈管壁Bcl-xl和Bax凋亡蛋白的陽性表達率

圖4 靜脈管壁ECs和SMCs的超微結構變化

3 討論

在多細胞生物體中，細胞的增殖與死亡平衡是維持內環境穩定的重要環節[11]。細胞凋亡是一種生理性、程序性的細胞死亡方式。細胞凋亡的形態學及生物學特征是核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成180～200 bp片段，胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體[12]。研究表明，細胞凋亡失調與靜脈疾病的病理變化密切相關[13]。細胞凋亡包括內源性和外源性兩條通道。內源性通道又稱線粒體通道，通過調節細胞凋亡啟動蛋白（Bax或Bcl-2）及半胱天冬酶（Caspase）刺激線粒體釋放細胞色素C進入胞漿與凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor 1，APAF-1）結合，引發細胞凋亡。外源性通道又稱跨膜通道，在細胞凋亡信號的刺激下，Fasl和腫瘤壞死因子-α作用于相應的受體，導致細胞凋亡[14-16]。研究發現，缺氧可導致細胞凋亡下調，縮短細胞周期，引起靜脈壁的平滑肌細胞過度增生，由此引發靜脈管壁重塑[4，17]。當Bax基因蛋白下降時，平滑肌細胞凋亡下調，曲張靜脈管壁細胞凋亡明顯低于正常靜脈[3]。正常情況下，一氧化氮和γ-干擾素能促進靜脈管壁的細胞凋亡。組織內存在高鐵離子時，T細胞增殖會替代細胞凋亡[18]。可見曲張靜脈管壁細胞凋亡使內皮細胞和平滑肌細胞代謝失衡，內源性凋亡通道抑制，出現細胞堆積、老化、結構異常，管壁的成分與結構發生相應改變。

關于曲張靜脈管壁細胞凋亡的文獻已有報道，但結果不一，各持己見。DUCASSE等[9]研究表明，曲張靜脈管壁結構紊亂，其膠原纖維和彈性纖維比例失調。TUNEL染色顯示，中膜細胞凋亡明顯減少。在正常靜脈中，過氧化物酶、Bax和Caspase-9凋亡蛋白表達明顯降低。ASCHER等[3]研究發現，曲張組Bax凋亡蛋白呈低表達，正常組Bcl-x凋亡蛋白呈高表達。曲張組內膜和中膜聚合酶呈低表達，外膜不表達；正常組聚合酶則呈高表達，結果表明，在靜脈高壓和缺氧條件下，控制細胞凋亡的內源性通道失調，導致靜脈壁擴張和增厚。有學者認為，細胞凋亡與年齡有關。＞50歲患者靜脈管壁內皮細胞和平滑肌細胞凋亡明顯增多，這可能與其他信號通道開放有關[19-20]。FILIS等[6]則發現，曲張靜脈管壁Bax、Caspase-3、Bcl-xl、Bcl-xs及Ki-67表達升高，細胞凋亡增多，遠端主干比近端主干更明顯。由此可見，細胞凋亡與靜脈管壁重塑密切相關，并受諸多因素影響。

本實驗行TUNEL染色和免疫熒光檢測后發現，血栓組和曲張組管壁（內膜和中膜）中可見散在的凋亡細胞，其分布基本相同。對照組管壁（內膜和中膜）則見較多的凋亡細胞。血栓組和曲張組管壁Bax凋亡蛋白陽性表達減少，Bcl-xl凋亡蛋白陽性表達增加；對照組則與血栓組和曲張組相反。定量分析表明，血栓組和曲張組管壁（內膜和中膜）凋亡細胞比率明顯低于對照組。電鏡顯示，3組靜脈管壁存在ECs和SMCs凋亡，其形態學特征為線粒體模糊、嵴斷裂、髓樣變、粗面內質網增寬、脫顆粒、核染色質邊集。本研究結果與DUEASSE等[21]報道一致。結果提示，靜脈高壓和缺氧可能導致靜脈管壁內源性通道細胞凋亡失調，以降低細胞的更新[4，22-23]。一方面組織缺氧會導致細胞應激，增加抗凋亡蛋白（Bcl-2），減少Caspase-9裂解作用及線粒體外膜的滲透性，由此阻斷內源性線粒體通道[24-25]；另一方面Fas和Caspase-8激活，導致跨膜通道受阻[26-27]。本研究結果證實，血栓組和曲張組管壁細胞凋亡與靜脈管壁結構改變關系密切，該結論符合筆者前期的研究結果（光鏡下血栓組和曲張組內皮細胞異常或不連續，平滑肌細胞肥大或增生，膠原纖維大量增多，滋養血管增多和異常。電鏡下內皮細胞變性或缺失，平滑肌細胞去分化由收縮型轉為分泌型）[28]。筆者認為，靜脈管壁組織學和形態學改變是細胞凋亡的動態平衡基礎。凋亡的上調和下調是組織本身一種代償性、生理性自我保護。血栓性靜脈炎和曲張靜脈管壁細胞凋亡水平明顯下降，提示靜脈管壁內源性凋亡通道抑制，推測靜脈高壓可能是影響細胞凋亡的啟動因素之一。本研究存在一定的局限性，觀察者間和觀察者內的差異性及人口學因素均可影響實驗結果。另外，單中心的結果有待多中心研究進一步驗證。

致敬本課題得到濰坊醫學院病理教研室張寶剛教授和電鏡室張圣明教授的大力幫助，在此表示衷心的感謝！

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（童穎丹 編輯）

Changes in levels of apoptosis in walls of superficial thrombophlebitis*

Yan－ping SUN1,Hong－juan WU2,Lei WANG3,Yong－bo XU1,Jin－yuan TANG1, Kun LI1,Jing－jing ZHANG1,Hu LI1,Hai－bo CHU1
(1.Department of General Surgery,the 89th Hospital of PLA,Weifang,Shandong 261021, P.R.China;2.Department of Electron Microscope,3.Department of Postgraduate, Weifang Medical College,Weifang,Shandong 261042,P.R.China)

【Objective】To investigate the relationship between apoptosis and great saphenous varicose veins by detecting the changes in levels of apoptosis in venous walls.【Methods】Totally 50 specimens of great saphenous veins[25 specimens with superficial thrombophlebitis(thrombosis group)and 25 specimens of simple varicose veins(varicose group)]as well as 15 specimens of normal great saphenous veins(control group)were collected.Apoptosis as well as Bax and Bcl－xl protein expressions were evaluated by the TUNEL assay and immunofluorescence staining.The morphology of apoptotic cells was observed with electromicroscope.【Results】In the thrombosis and varicose groups,the apoptotic cell rates in the venous walls(intima and media)were significantly lower than those in the corresponding regions in the control group(P＜0.01).The high expression of Bcl－xl protein was detected in the thrombosis and varicose groups,while the high expression of Bax protein was observed in the control group.Electromicroscopic observation confirmed that endothelial and smooth muscle cells in the three groups exhibited apoptotic morphologic features,such as fuzzy mitochondrial cristae,medullary changes and margination of the nuclear chromatin.【Conclusions】Our results showed that dysregulation of apoptosis via the intrinsic pathways in varicose veins leads to the downregulation of apoptosis,which results in wall thickening and an increase in the lumen.This may be one of the mechanisms of venous diseases.

superficial thrombophlebitis;varicose vein;saphenous vein;apoptosis

R543.6；Q253

A

1005-8982（2015）32-0049-006

2015-08-12

濰坊市科技發展計劃（No：2014zj1058）；解放軍第89醫院科研資助基金（No：yz2013890201）

褚海波，E-mail：haibochuwf@163.com；Tel：0536-8439081；13863679579