CD73在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

邢秀月

（海南省瓊海市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 瓊海 571400）

·臨床論著·

CD73在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

邢秀月

（海南省瓊海市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 瓊海 571400）

目的探討CD73在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床價(jià)值。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織和74例正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達(dá)，并分析其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。采用Western blot隨機(jī)檢測(cè)4例宮頸癌組織及自身對(duì)應(yīng)正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達(dá)。結(jié)果宮頸癌組織中CD73蛋白表達(dá)的陽性率顯著高于CIN組織和正常宮頸上皮組織（P＜0.05）。CD73蛋白表達(dá)與宮頸癌患者年齡、組織學(xué)分化無關(guān)（P＞0.05），但與臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)表明，宮頸癌組織中CD73蛋白的表達(dá)顯著高于正常宮頸上皮組織（P＜0.05）。結(jié)論CD73有望成為評(píng)價(jià)宮頸癌惡性程度和預(yù)后的指標(biāo)。

CD73；宮頸癌；預(yù)后

1934年5-核苷酸酶（5’-nucleotidase，5’-NT）的活性首次在動(dòng)物心臟和骨骼肌中被描述。目前，發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)有7種5’-NT，其中5種位于細(xì)胞質(zhì)，1種位于線粒體基質(zhì)，1種附著在質(zhì)膜外，附著在質(zhì)膜外的簡(jiǎn)稱為eNT。1985年第四屆國際人類自細(xì)胞分化抗原會(huì)議中eNT被正式命名為CD73。CD73廣泛表達(dá)于人體多種組織細(xì)胞表面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD73在肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[1]，在缺氧條件下，促使腫瘤微環(huán)境中腺苷聚積，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[2]。但是迄今為止尚未見任何關(guān)于CD73在宮頸癌中的研究報(bào)道。因此，本研究利用免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)宮頸癌組織中CD73蛋白的表達(dá)，并研究其可能的臨床意義。本研究旨在為以CD73為分子靶點(diǎn)的宮頸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2010～2012年本院手術(shù)切除的74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neopiasia，CIN）組織和74例正常宮頸上皮組織標(biāo)本，并經(jīng)病理、組織學(xué)檢查確診。其中隨機(jī)選取4例宮頸癌組織[經(jīng)病理學(xué)診斷隨機(jī)選取，2例為Ⅱa期（低分化），1例為Ⅰa1期（中分化），1例為Ⅰa2期（高分化）]和自身對(duì)應(yīng)的正常宮頸上皮組織取樣后液氮保存?zhèn)溆茫蠾estern blot檢測(cè)。所有患者術(shù)前未接受任何形式的治療，包括放射治療、化學(xué)治療和免疫治療。患者年齡25～73歲，中位年齡41歲；其中≥45歲50例，＜45歲24例。按2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰa期21例，Ⅰb1期19例，Ⅰb2期21例，Ⅱa期13例。組織學(xué)分級(jí)：高分化18例，中分化37例，低分化19例。宮頸癌標(biāo)本中19例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。浸潤深度：≤1/2層36例，＞1/2層28例，全層10例。

1.2免疫組織化學(xué)法

CD73鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz，免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-perosidase）SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)法染色步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。CD73一抗稀釋濃度為1∶50，以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知的陽性宮頸癌切片為陽性對(duì)照組。

1.3結(jié)果評(píng)估

以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，具體的判定方法依照參考文獻(xiàn)[3]，即按照細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)作為評(píng)定方法，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野，每例標(biāo)本評(píng)價(jià)≥1000個(gè)細(xì)胞。染色強(qiáng)度：輕度著色1分，中度著色2分，強(qiáng)染色3分；陽性細(xì)胞＜10%為1分，陽性細(xì)胞10%～50%為2分，陽性細(xì)胞50%～80%為3分，≥80%為4分。將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)率相乘得到每例患者的染色總分，1～3分為陰性；4～12分為陽性。

1.4Western blot檢測(cè)

將組織從液氮中取出，研磨后用組織蛋白裂解液提取總蛋白，然后將提取的總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳。取下凝膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，用含5%脫脂奶粉的等滲鹽溶液加Tris-HCl緩沖液封閉NC膜2h，加入一抗CD73 1∶100，4℃搖床孵育過夜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，將NC膜置于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑中反應(yīng)1～3 min。暗室中利用X射線曝光，常規(guī)方法顯影定影，顯示特異的蛋白信號(hào)，蛋白表達(dá)的灰度值利用Image-Pro Pius 5.0軟件進(jìn)行分析。蛋白相對(duì)表達(dá)以目的基因與內(nèi)參基因的比值β-actin作為內(nèi)參照。每例樣品做3次實(shí)驗(yàn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同宮頸組織中CD73蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和74例正常宮頸上皮組織中CD73蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，CD73蛋白主要定位于宮頸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈淺黃色至棕黃色顆粒（見圖1）。CD73蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)的陽性率為79.7%，顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（36.7%）和正常宮頸上皮組織（10.8%），3組CD73蛋白的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=53.480，P＜0.01）（見表1）。

2.2CD73蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

CD73蛋白表達(dá)與宮頸癌患者的年齡和組織分化程度無關(guān)（P＞0.05），但與臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切（P＜0.05）。見表2。

圖1 CD73蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)

表1 CD73蛋白在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及正常宮頸上皮組織中的表達(dá)

表2 宮頸頸癌患者臨床病理參數(shù)與CD73蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.3Western blot檢測(cè)宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達(dá)

隨機(jī)選取的4例宮頸癌組織中，CD73蛋白的表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的正常宮頸上皮組織（P＜0.05）。見圖2。

圖2 CD73蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中的表達(dá)

3 討論

研究表明，CD73在腫瘤的生長、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。STAGG等[4]發(fā)現(xiàn)，CD73的活性在惡性程度較高的膀胱癌細(xì)胞中顯著增高，證實(shí)嘌呤信號(hào)途徑促進(jìn)膀胱腫瘤的形成。ZHI等[5]通過體內(nèi)外檢測(cè)觀察到轉(zhuǎn)染CD73 siRNA的惡性乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力被明顯抑制，表明CD73在體內(nèi)外能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。同時(shí)WANG等[6]證實(shí)CD73還能通過腺苷促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。最近研究發(fā)現(xiàn)，CD73表達(dá)上調(diào)的白血病T淋巴細(xì)胞能特異性地抑制人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)的凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。腫瘤細(xì)胞CD73高表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducing factor，HIF）、Wnt/13-catenin信號(hào)異常、干擾素-α（Interferon-α，IFN-α）及腺苷有關(guān)。腫瘤組織內(nèi)普遍缺氧，缺氧條件可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF二聚體產(chǎn)生，該二聚體與CD73基因啟動(dòng)子中缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）結(jié)合，促進(jìn)CD73基因的轉(zhuǎn)錄[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)中的β-catenin可以通過轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子-β（T-cell factor-β，TCF-β），作用于CD73基因的TCF/淋巴增強(qiáng)因子（lymphoid enhancing factor，LEF）結(jié)合位點(diǎn)，強(qiáng)烈增加CD73啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α能促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞CD73的表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，IFN-α通過間接地誘導(dǎo)其他調(diào)控介質(zhì)來促進(jìn)CD73基因轉(zhuǎn)錄[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，腺苷通過激活瘤細(xì)胞表面腺苷受體，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）增加，cAMP通過血肌酐結(jié)合蛋白與CD73基因的血肌酐結(jié)合，從而正反饋性調(diào)節(jié)CD73基因的轉(zhuǎn)錄[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇能夠通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）下調(diào)CD73基因表達(dá)。研究證實(shí)，ER是通過CD73基因啟動(dòng)子中的Sp-1和Ap-2結(jié)合位點(diǎn)間接下調(diào)CD73基因表達(dá)[12]。CD73在多種不同的腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，表明其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但尚未見關(guān)于CD73在宮頸癌中的研究報(bào)道。

本研究通過分析74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和74例正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其CD73蛋白表達(dá)的陽性率分別為79.7%、36.7%和10.8%，3組CD73蛋白的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示宮頸癌中高表達(dá)的CD73可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該結(jié)果與CD73在其他腫瘤中的表達(dá)具有顯著的一致性[4-6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD73蛋白表達(dá)與宮頸癌患者的年齡、組織分化程度無關(guān)（P＞0.05），但與臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切（P＜0.05）。利用免疫組織化學(xué)法了解CD73蛋白的表達(dá)和定位后，本實(shí)驗(yàn)采用更為靈敏的Western blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)宮癌組織中CD73蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宮頸癌組織中CD73蛋白的表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。更為重要的是，本實(shí)驗(yàn)在采用Western blot檢測(cè)3號(hào)樣品正常宮頸上皮組織時(shí)，未發(fā)現(xiàn)CD73蛋白的表達(dá)，該結(jié)果從某種程度上進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的可靠性。

總之，本研究表明宮頸癌組織中存在高水平的CD73，其高表達(dá)與腫瘤的臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是其相關(guān)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，有望為以CD73為靶點(diǎn)的宮頸癌基因治療提供新的理論依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Expression of CD73 protein in cervical carcinoma tissues and its clinical significance

Xiu－yue XING
(Department of Obstetrics and Gynecology,the Ppeople's Hospital of Qionghai City,Qionghai,Hainan 571400,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of CD73 in cervical carcinoma tissues and its clinical value.【Methods】Immunohistochemistry was used to detect the expression of CD73 in 74 cervical carcinoma tissues,49 cervical intraepithelial neoplasia(CIN)tissues and 74 normal cervical epithelial tissues.The relationships between the expression of CD73 and clinical pathological features were analyzed.The expression of CD73 in randomly selected 4 cervical carcinoma tissues and paired normal cervical epithelial tissues was detected by Western blot.【Results】The positive expression rate of CD73 protein in the cervical carcinoma tissues was significantly higher than that in the CIN tissues and normal cervical epithelial tissue and there were significantly differences among the 3 groups(P＜0.05).The expression of CD73 was not related to the age or histological differentiation(P＞0.05),but closely associated with clinical stage,invasive depth and lymph node metastasis(P＜0.05).Furthermore,Western blot results demonstrated that the level of CD73 in the cervical carcinoma tissues was markedly higher than that in the normal cervical epithelial tissue(P＜0.05).【Conclusion】CD73 may be an important molecular marker for evaluating malignant degree and prognosis of cervical carcinoma.

CD73;cervical carcinoma;prognosis

R737.33

A

1005-8982（2015）32-0055-04

2015-03-09