一遺傳性心臟傳導阻滯疾病家系的基因突變篩查*

蔣云山，黃河，黃向紅，李輝，范雙喜，李輝瑩，盧永娟，譚小軍

（湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

一遺傳性心臟傳導阻滯疾病家系的基因突變篩查*

蔣云山，黃河，黃向紅，李輝，范雙喜，李輝瑩，盧永娟，譚小軍

（湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

目的對一個常染色體顯性遺傳性心臟傳導阻滯疾病（CCD）家系進行已知致病基因的篩查。方法以該家系為研究對象，獲取相關臨床資料，提取外周血基因組DNA。選擇3個已知與遺傳性CCD相關的候選基因：心臟特異性同源盒基因（NKX2.5）、心臟鈉離子通道α亞單位基因（SCN5A）和核纖層蛋白基因（LMNA），對5例患者進行基因直接測序篩查。針對發(fā)現(xiàn)有突變的外顯子，對其余成員的DNA樣本同樣進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增和序列分析。結果遺傳性CCD家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳，臨床表現(xiàn)符合遺傳性CCD。對家系中患者及其他成員進行相關致病基因的所有外顯子及其剪切位點區(qū)域的直接測序分析，未發(fā)現(xiàn)能引起編碼氨基酸改變的堿基突變。結論遺傳性CCD家系診斷為Lenègre-Lev病。初步的分子遺傳學篩查未檢測到該家系中存在NKX2.5、SCN5A和LMNA基因的有意義突變，提示可能存在其他致病基因參與CCD的發(fā)生，有待進一步研究。

常染色體顯性遺傳；進行性心臟傳導阻滯；Lenègre-Lev病；基因突變；家系

心臟傳導阻滯（cardiac conduction defect，CCD）是一類嚴重的潛在威脅生命的疾病[1]。其中最常見的是特發(fā)性雙邊束支纖維化病（又稱Lenègre-Lev病）。目前研究證實，基因突變是遺傳性CCD的常見病因，其中心臟特異性同源盒基因（cardiac-specific homeobo，NKX2.5）、心臟鈉離子通道α亞單位基因（voltage-gated sodium channeltypeⅤ，SCN5A）和核纖層蛋白基因（lamin A/C，LMNA）突變與遺傳性CCD的相關性得到多篇文獻的論證。

本課題組收集到1個5代共68例的常染色體顯性遺傳性CCD家系成員，前期研究結果發(fā)表在2009年第6期的《中國心臟起搏與心電生理雜志》。該家系診斷為Lenègre-Lev病，但心電圖特征提示Lenègre-Lev病可能存在第3型，即最初發(fā)病部位在心房內傳導系統(tǒng)，以后病變逐步沿心臟特殊傳導系統(tǒng)向His束發(fā)展，并演變?yōu)棰蠖确渴覀鲗ё铚╝trial ventricular block，AVB）。該家系特殊的起病方式是否與上述已知基因突變或其他基因相關尚不清楚。本課題組通過直接測序方法對已知的CCD相關候選基因進行突變篩查，以期找到致病基因，有利于研究發(fā)病機制，篩選出家系中的潛在患者，提醒其采取防范措施，避免猝死發(fā)生，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象

筆者收集到湘潭市的1個CCD家系，該家系有5代共68例家系成員。其中7例為CCD患者（現(xiàn)存4代60例，5例患者）。先證者（Ⅲ19）為57歲男性，37歲時因心悸短暫暈厥就診，心電圖（electrocardiogram，ECG）檢查為Ⅰ度AVB，超聲心動圖（ultrasound cardiogram，UCG）檢查提示心臟4個腔室大小正常；41歲時進展為Ⅲ度AVB和房顫，UCG檢查提示心臟擴大，47歲時行右心室按需型起搏器植入術。對該家系中患者及其親屬共22例成員進行病史詢問、心肺檢查、ECG檢查，并抽取外周靜脈血5～10ml用于基因組DNA的提取。本實驗由湘潭市中心醫(yī)院生殖中心及心內科共同完成，對該家系的分子遺傳學研究通過醫(yī)院倫理委員會的論證。

應用Cyrillic 3.0軟件繪制圖譜。通過系譜圖分析得知，該CCD家系表現(xiàn)為4代連續(xù)遺傳（其中Ⅰ1突然猝死，原因不詳，疑為CCD患者，第5代因年齡小，未見發(fā)病）；男女發(fā)病幾率相同，而且患者后代有50%左右的發(fā)病率；家系中已經(jīng)明確診斷的患者有7例，其中男性5例，女性2例。Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ7在50～75歲猝死，死因不詳。見圖1。

圖1 Lenègre-Lev病系譜圖

1.2臨床心電圖檢查

根據(jù)《新編臨床醫(yī)學數(shù)據(jù)手冊》對家系內成員進行心肺檢查，檢查內容包括體表心電圖。完全性右束支阻滯（right bundle branch block，RBBB）3例（其中1例演變?yōu)棰穸華VB），Ⅰ度AVB 2例（其中1例演變?yōu)棰蠖華VB），Ⅱ度AVB 2例，Ⅲ度AVB 2例，Ⅱ度竇房傳導阻滯（sinoatrial block，SAB）2例，均表現(xiàn)為CCD。其中，先證者Ⅲ19的心電圖檢查由完全性RBBB演變?yōu)棰蠖華VB伴有RBBB和Ⅱ度SAB。接受檢查的家系成員心電圖檢查結果見表1。

先證者（Ⅲ19）ECG檢查提示Ⅲ度AVB、竇性心動過緩、交界性逸搏心率（見圖2A）。先證者堂兄（Ⅲ5）2001年ECG提示完全性RBBB、竇性心動過緩、Ⅰ度AVB，UCG及核素心肌掃描正常，臨床診斷為原發(fā)性傳導束退化癥；2007年ECG提示Ⅲ度AVB、完全性RBBB、Ⅱ度SAB，冠狀動脈造影正常，UCG檢查雙心房擴大（見圖2B）。先證者堂姐妹（Ⅲ31）ECG提示竇性心動過緩和完全性RBBB。先證者侄子（Ⅳ14）ECG提示竇性心動過緩、Ⅱ度AVB、ST-T改變、房性早搏未下傳。先證者之子（Ⅳ21）ECG提示Ⅱ度Ⅰ型房室傳導阻滯。

圖2 ECG檢查

1.3研究方法

1.3.1樣本采集及DNA的提取按照血液基因組DNA提取試劑盒（Qiagen）說明書抽提外周血白細胞的基因組DNA。取適量DNA經(jīng)紫外分光光度計進行定量和純度檢測，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2候選基因的選擇和引物設計參考美國國立生物技術信息中心基因數(shù)據(jù)庫的基因組和mRNA序列信息，結合已發(fā)表的文獻，設計覆蓋已知的CCD發(fā)生相關基因SCN5A、NKX2.5和LMNA的全部外顯子及其剪切位點區(qū)域的引物，其中SCN5A有2個外顯子，NKX2.5有28個外顯子，LMNA有12個外顯子，引物序列見表2。所有引物由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 Lenègre-Lev病家系成員的臨床檢查結果

1.3.3聚合酶鏈反應以基因組DNA為模板，采用

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法擴增目的DNA片段。本研究采用的PCR反應體系為50μl，其中包括100μg基因組DNA，10 mol/L引物，200 mmol/L dNTP和Tag酶。PCR反應在DNA熱循環(huán)儀（美國Bio-rad公司）上進行，反應條件如下：95℃預變性2 min，94℃變性10 s，65℃退火30 s，68℃延伸2 min，共35個循環(huán)。取5μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，100 bp DNA Marker鑒定擴增片段。

續(xù)表1

表23 個候選基因的PCR和測序引物

續(xù)表2

1.3.4測序分析PCR產(chǎn)物送深圳華大生物技術有限公司純化后直接測序（ABI377自動DNA測序儀）。測序引物與PCR引物相同。參考已報道的致病基因突變位點和美國國立生物技術信息中心提供的候選基因SCN5A、NKX2.5和LMNA的標準基因序列，應用DNAman軟件對測序結果進行序列分析比對，判斷是否存在突變位點及氨基酸序列的變化。若發(fā)現(xiàn)可疑突變，重新稀釋DNA模板，對基因外顯子進行重復實驗和反向測序予以驗證。

2 結果

選取Ⅲ5、Ⅲ7、Ⅲ19、Ⅳ14及Ⅳ21共5例患者進行LMNA和SCN5A、NKX2.5基因全部外顯子和部分剪切位點區(qū)域DNA片段的PCR擴增，凝膠電泳分析可見特異性條帶，與預期結果相符。PCR擴增片段產(chǎn)物純化后經(jīng)直接測序分析，未發(fā)現(xiàn)與已報道的候選基因一致的突變位點。

3 討論

本課題組黃河等[2]證實遺傳性CCD家系疾病被診斷為Lenègre-Lev病。Lenègre-Lev病是以心房和心室內傳導系統(tǒng)異常為特征的一種疾病；主要特點為希浦系的心臟內傳導系統(tǒng)出現(xiàn)進行性傳導異常，導致房室或室內傳導阻滯；病因不明，該病具有一定的異質性，病情嚴重時可導致暈厥或猝死[1，3]。因此，篩查致病基因對該家系疾病的分子機制研究及預防猝死極為重要。

CCD是一種多重病因的遺傳異質性疾病，其中遺傳學因素在CCD發(fā)病中的作用日益受到重視。該病一般以常染色體顯性的方式遺傳[4]。該家系患者雙親之一為CCD患者或疑似患者，男女均可發(fā)病，有連續(xù)傳代的特點，符合常染色體顯性遺傳病的特征，與文獻報道一致。

近年來，國內外研究發(fā)現(xiàn)多種基因異常與CCD有關，其中較多的是3個主要候選基因SCN5A、NKX2.5和LMNA突變能夠引發(fā)進行性CCD的證據(jù)。

3.1SCN5A基因

SCN5A基因位于染色體3p21，編碼心肌細胞膜上的鈉離子電壓門控通道Nav1.5。其突變后可引起Navl.5結構異常，造成快鈉通道功能障礙，快反應細胞動作電位0期鈉離子內流減少，去極化速率以及幅值減小，從而降低傳導速度，引起傳導阻滯。SCN5A基因突變后可引起病態(tài)竇房結綜合征（sick sinus syndrome，SSS）[5]、進行性以及非進行性CCD[6-9]等多種心臟傳導疾病。周熙惠等[10]發(fā)現(xiàn)1個CCD家系SCN5A基因新突變L1001Q。功能研究顯示，該突變主要通過改變鈉通道門控特性，引起鈉通道功能減弱，導致CCD。鄧堯等[11]通過全外顯子測序發(fā)現(xiàn)一心臟傳導疾病家系的SCN5A新的雜合突變P. Y1495X。此外，國外多位學者發(fā)現(xiàn)，SCN5A多個位點的錯義突變、無義突變、移碼突變等可導致CCD。

3.2NKX2.5基因

人類CSX/NKX2.5基因定位于染色體5q34和5q35，有972 bp的開放閱讀框，編碼含324個氨基酸的蛋白質。人類CSX/NKX2.5蛋白同源結構域HD含有高度保守的60個氨基酸殘基，是與DNA結合的必需結構。NKX2.5基因是心臟發(fā)育過程中重要的轉錄因子，是所有脊椎動物心臟發(fā)生中最早表達的轉錄因子之一，參與心臟前體細胞的分化、心臟環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導系統(tǒng)的形成[12]。多篇文章報道NKX2.5基因的突變可導致CCD[13-16]。

3.3LMNA基因

LMNA基因位于染色體1q21.2～q21.3，基因組序列全長56.7 kb其中編碼區(qū)域約24 kb，包含l2個外顯子[17]。LMNA基因編碼蛋白產(chǎn)物為Lamin A和C，是組成細胞核纖層的重要成分，在心臟傳導系統(tǒng)形態(tài)學的發(fā)生、發(fā)育和功能維持方面發(fā)揮重要的調控作用，突變可導致多種遺傳性疾病，包括CCD[18-21]。

本課題組通過直接測序法對家系患者的SCN5A、NKX2.5和LMNA基因的全部外顯子和部分剪接區(qū)域進行突變篩查。結果既未發(fā)現(xiàn)已知的致病突變，也未檢測到新的致病位點，提示本家系CCD發(fā)病機制可能與其他基因突變有關。本課題組下一步將針對家系中的關鍵患者及正常人開展全外顯子組掃描分析，判斷是否與已知基因存在連鎖，結合外顯子組測序和生物信息學分析繼續(xù)對該家系的致病性突變位點定位和驗證，并對新的致病基因功能進行觀察和分析，為遺傳學檢查、產(chǎn)前診斷、新生兒篩查及疾病治療等提供依據(jù)，為闡明CCD的分子遺傳學機制提供新的線索。

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（童穎丹 編輯）

Gene mutation screening in a Chinese pedigree with genetic cardiac conduction block*

Yun-shan JIANG,He HUANG,Xiang-hong HUANG,Hui LI,Shuang-xi FAN, Hui-ying LI,Yong-juan LYU,Xiao-jun Tan
(Xiangtan Central Hospital,Xiangtan,Hunan 411100,P.R.China)

【Objective】To screen the known causative gene mutations in a Chinese pedigree suffered from autosomal dominant cardiac conduction block disease.【Methods】A Chinese pedigree with genetic cardiac conduction block was collected as the research subjects.ECGs of the family members were analyzed, their peripheral venous blood was collected and genomic DNA was extracted.Three known candidate genes [cardiac-specific homeobox 1(NKX2.5),voltage-gated sodium channel typeⅤ(SCN5A)and lamin A/C(LMNA)]associated with genetic cardiac conduction block were screened in 5 patients by direct gene sequencing. The mutant exons discovered were then screened in the remaining members using PCR and gene sequencing.【Results】The inheritance mode of the family was autosomal dominant.Clinical manifestations of the patients conformed to genetic heart block.Direct gene sequencing analysis of the 3 genes in the patients of this pedigree did not reveal the causative gene mutations.【Conclusions】This pedigree has been diagnosed as Lenègre-Lev disease.The causative gene mutations have not been found in screening of NKX2.5,SCN5A and LMNA gene mutations,suggesting the presence of other causative genes in this genetic cardiac conduction disease,which needs further study.

autosomal dominant inheritance;progressive cardiac conduction block;Lenègre-Lev disease; gene mutation;pedigree

R541.76；R394

B

1005-8982（2015）32-0063-07

2015-04-27

湘潭市科技計劃重點項目（No：ZD20121017）

譚小軍，E-mail：changdaot@163.com；Tel：18607321777