廣西壯族及漢族人群CD40基因rs4810485 G／T遺傳多態性

向陽藍艷羅宏成陳健明吳成將蔣遠文韋葉生★

·論著·

廣西壯族及漢族人群CD40基因rs4810485 G／T遺傳多態性

向陽1藍艷2羅宏成1陳健明1吳成將1蔣遠文2韋葉生1★

目的研究CD40基因rs4810485 G／T多態性各等位基因及基因型在廣西地區壯族及漢族人群中的分布頻率，比較其在不同種族間分布的差異。方法采用單堿基延伸的PCR技術和DNA測序法檢測195例壯族人和200例漢族人的CD40基因rs4810485 G／T多態性，比較兩組CD40基因型及等位基因的分布頻率；并結合文獻進行不同種族間的比較分析。結果在壯族人中GG基因型占24.1％、GT基因型占49.2％、TT基因型占26.7％；在漢族人中GG基因型占30.0％、GT基因型占47.0％、TT基因型占23.0％。在廣西壯族及漢族人群中CD40基因多態性的分布頻率差異均無顯著性（P＞0.05），但與波蘭人、英國人及西班牙人比較，CD40基因多態性的分布頻率均存在顯著性差異（P＜0.05）。結論在廣西地區壯族及漢族人群中存在CD40基因多態性，其基因多態性的分布頻率差異無顯著性，但與其他種族人群比較存在顯著性差異。這種差異對于人類學的研究可能起重要的作用。

CD40；基因多態性；種族

CD40（白細胞分化抗原-40）是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，分布于多種免疫細胞及腫瘤細胞表面。與其配體CD40L結合后，可以將細胞外的信號傳導至胞內，引起一系列生物學效應［1，2］。編碼它的基因位于20號染色體長臂（q12-q13.2）上，含有9個外顯子和8個內含子。CD40基因存在著基因變異及基因多態性，這種基因多態性與人類動脈粥樣硬化性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤的關系，已成為國內外學者研究的熱點［3－5］。為此，我們應用單堿基延伸PCR技術和DNA序列測定法，進行CD40基因多態性研究，對認識遺傳因素的發病作用具有重要意義；同時，確定其在正常人群中的分布，將為人類學及群體遺傳學研究提供前瞻性基礎資料。

1 對象與方法

1.1 對象

廣西地區壯族人195例，其中男115人，女80人，年齡25～72歲；漢族200例，其中男110人，女90人，年齡22～75歲。血常規、血脂及其他生化指標均在參考范圍內，心電圖檢查正常，排除肝臟、腎臟、內分泌和心腦血管等疾病。全部研究對象均來自右江民族醫學院附屬醫院，為正常健康體檢者，且相互間無血緣關系。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采集體檢健康者靜脈血3 m L，用EDTA-K2抗凝；采用我們已建立的改良碘化鈉法［6］提取白細胞基因組DNA，－70℃保存備用。

1.2.2 引物設計與合成

根據CD40基因rs4810485 G／T位點多態性和已知的DNA序列設計PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴增CD40基因包含rs4810485 G／T位點堿基的DNA片段的引物，上游引物序列為：5′-ATCCCCCAAGTACC TGGCTCCT-3′；下游引物序列為：5′-CCTTGCT GCTTCCCTTGCTTTC-3′，延伸引物為：5′-TTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTACTTTAGA G G GCTGTAGATTCC-3′。

1.2.3 PCR擴增

CD40的PCR擴增反應體系為20μL，其中含10×PCR緩沖液2.0μL，0.3 mmol／L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補足至20μL。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產物經蝦堿酶（SAP）（Promega）和外切酶I（EXO I）（Epicentre）純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用蝦堿酶（SAP）（Promega）純化后在ABI3130XL上樣。SNP分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）來分析。

1.3 統計分析

用SPSS 11.5軟件包進行分析。基因型和等位基因頻率采用基因直接計數法計算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為統計學意義。

2 結果

2.1 CD40基因型檢測結果

CD40基因rs4810485 G／T多態性，PCR擴增產物片段大小為131 bp。經ABI3130XL基因檢測儀SNP分型結果顯示rs4810485 G／T位點檢測到GG、GT和TT三種基因型。基因測序進一步證實我們的結果（圖1）。

2.2 CD40基因多態性在壯、漢兩民族人群中分布頻率的比較

計算廣西壯、漢兩民族健康人群中CD40基因型和等位基因頻率，經χ2檢驗，CD40基因rs4810485 G／T位點的基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明所選的研究樣本具有群體代表性。其中rs4810485 G／T位點基因型在壯、漢民族中以GT型最為常見，分別占

49.2％和47.0％。其基因型和等位基因頻率分布在男女性別間比較無顯著性差異（P＞0.05）；廣西壯族及漢族人群中CD40基因多態性的分布頻率也無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

圖1 CD40基因rs4810485 G／T測序圖Figure 1 Sequencing map of CD40 gene rs4810485 G／T polymorphism

表1 廣西壯族和漢族人群CD40基因型和等位基因分布頻率的比較Table 1 The distribution of genotype and allele frequencies of CD40 gene in Guangxi Zhuang and Han populations

2.3 CD40基因多態性在不同種族人群間的比較

廣西漢族人群CD40基因型和等位基因頻率分別與波蘭人［4］、英國人［7］、西班牙人［8］比較差異均有顯著性（P＜0.05）；而與臺灣人［9］及廣西壯族人比較差異均無顯著性（P＞0.05）（表2）。

表2 不同種族及地區人群CD40基因rs4810485 G／T多態性分布頻率的比較Table 2 Comparisons of frequency distribution of CD40 gene rs4810485 G／T polymorphism among different ethnic and regional groups

3 討論

隨著人類基因組研究的進展，人們已經認識到不同的基因背景可以造成某些疾病不同的易感性。對于人類基因多態性的研究已成為必然，其漸成為一種解釋不同人群中一些疾病存在不同發病率或不同臨床表現、治療反應及預后的內在機制。廣西是我國多民族聚居最突出的地區，通過研究不同民族基因多態性，不僅有助于探索各民族間的相互關系，而且對于探索某些致病基因和易感基因的分布特征、研究某些疾病的發病機理及基因水平的診斷和治療有重要意義。我們對廣西壯族和漢族CD40基因多態性進行對比研究，為探索人類的起源、動脈粥樣硬化性疾病、腫瘤及自身免疫性等疾病的基因遺傳背景提供理論依據和分子生物學基礎。

CD40是腫瘤壞死因子受體超家族成員，是特異性免疫應答的中心分子，廣泛表達于免疫細胞表面，包括B細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，同時也表達于上皮細胞、內皮細胞、血小板等非免疫細胞的表面。CD40高親和力與其配體CD40L結合，對T／B細胞活化和細胞因子的產生起誘導作用，參與多種疾病的發生發展。CD40基因位于20號染色體長臂（q12-q13.2）上，其所編碼蛋白產物含有277個氨基酸。CD40基因存在rs4810485 G／T單核苷酸多態性，這種基因多態性的存在可能影響CD40基因的功能，進而可能影響到CD40基因多態性與系統性紅斑狼瘡、川崎病等的發生發展［10，11］。因此，正確分析和闡明CD40基因多態性在不同種族和地域人群中的分布特點，為進一步研究不同人群中CD40基因多態性與某些疾病的發生發展之間的關系提供理論依據和分子遺傳學基礎。

我們采用單堿基延伸PCR技術檢測了廣西地區壯族及漢族正常人群中CD40基因rs4810485 G／T位點多態性的分布情況，結果顯示，在壯族人中GG基因型占24.1％、GT基因型占49.2％、TT基因型占26.7％；在漢族人中GG基因型占30.0％、GT基因型占47.0％、TT基因型占23.0％。在廣西壯族及漢族人群中CD40基因多態性的分布頻率無顯著性差異（P＞0.05）；其基因型和等位基因頻率分布在男女性別間比較也無顯著性差異（P＞0.05）。進一步將中國廣西地區漢族人與波蘭人［4］、英國人［7］、西班牙人［8］、臺灣人［9］等人群基因多態性研究結果比較分析發現，我國廣西漢族人群中CD40基因rs4810485 G／T位點T等位基因頻率（46.5％）顯著高于波蘭人（24.3％）、英國人（25.2％）和西班牙人（27.2％），差異具有統計學意義（P＜0.05）；與臺灣人及廣西壯族人等比較差異無顯著性（P＞0.05）。從本文結果可以發現，CD40基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在著明顯的差異，這一結果符合遺傳學規律，即親緣關系越近，其基因型分布越相似，反之則差異越顯著。

綜上所述，了解我國壯族與漢族人群中CD40基因多態性的分布，不僅為今后進一步研究我國壯族與漢族人群中CD40基因多態性與一些相關疾病發生、發展之間的關系提供理論依據，也將有助于我們更深入的理解這些疾病在不同種族、不同地區間具有的不同的遺傳基因背景；同時也為進一步的人類學及群體遺傳學的研究和基因多態性普查奠定了基礎，并為進行疾病前瞻性研究提供了重要的基礎資料。

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The genetic polymorphism of CD40 gene in GuangxiZhuang and Han populations

XIANG Yang1,LAN Yan2,LUO Hongcheng1,CHEN Jianm ing1,WU Chengjiang1,JIANG Yuanwei2,WEI Yesheng1★
(1.Department of Laboratory Medicine,A ffiliated Hospital of Youjiang Medical University for N ationalities, Baise,Guangxi,China,533000；2.Departmentof Dermatology,A ffiliated Hospital of Youjiang Medical University for N ationalities,Baise,Guangxi,China,533000)

Objective To study the frequencies of allele and genotype distribution of CD40 gene rs4810485 G/T polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations,and to analyze the distributions of CD40 polymorphism among differentethnic groups.Methods The CD40 gene rs4810485 G/T polymorphism was exam ined by the polymerase chain reaction-single base extension(PCR-SBE)technique and DNA sequencing methods in 195 Zhuang and 200 Han populations.Genotype and allele frequencies of CD40 were compared between Zhuang and Han populations，as well as w ith other different races.Results The frequencies of GG,GT and TT genotypeswere 24.1％,49.2％and 26.7％in the Zhuangs,and 30.0％,47.0％and 23.0％ in the Hans，respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of CD40 gene were not significant difference between the Zhuangs and the Hans(P＞0.05).Compared w ith Spanish and Russian populations,the

CD40；Polymorphism；Ethnic

國家自然科學基金（81260234）；廣西自然科學基金（2011GXNSFA018198）；廣西衛生廳重點科研課題（重2012086）

1.右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西，百色533000 2.右江民族醫學院附屬醫院皮膚科，廣西，百色533000

★通訊作者：韋葉生，E-mail：wysh22＠163.com

CD40 polymorphism was significantly difference(P＜0.05).Conclusion There are CD40 gene polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations.T he frequencies of polymorphism distribution of CD40 gene were not significant difference between the Zhuang and Han populations.Whose distributions are significantly difference compared w ith others ethnic populations.Itmight play an important role for anthropological research.