菟絲子總黃酮對血管平滑肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白的影響

王曉敏　席曉甜　劉海云　謝　斌　(江西中醫藥大學基礎醫學院，江西　南昌　330004)

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菟絲子總黃酮對血管平滑肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白的影響

王曉敏席曉甜劉海云謝斌(江西中醫藥大學基礎醫學院，江西南昌330004)

〔摘要〕目的觀察菟絲子總黃酮對血管平滑肌細胞凋亡的影響，并探討其保護作用機制。方法菟絲子經溶劑提取，聚酰胺柱分離得黃酮提取物;大鼠胸主動脈平滑肌細胞傳代培養，實驗分四組，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡、Westen印跡法測定細胞Bcl-2和Bax蛋白表達及RT-PCR測定C-myc基因表達情況。結果菟絲子總黃酮高劑量組能夠增加活細胞數量，降低死亡細胞數，特別是降低早期凋亡細胞數，與模型組比較有顯著差異(P＜0. 05);菟絲子總黃酮高劑量組能夠下降Bax蛋白表達量，與模型組比較有顯著差異(P＜0. 05)，而菟絲子總黃酮低劑量組升高Bcl-2蛋白表達量，與模型組比較有顯著差異(P＜0. 05);菟絲子總黃酮高劑量和低劑量組C-myc mRNA表達量顯著升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0. 05)，無劑量依從效應。結論菟絲子總黃酮能抑制平滑肌細胞凋亡，其可能是通過能夠下降Bax蛋白和升高Bcl-2蛋白表達，改善抗凋亡和促凋亡的蛋白失衡，增加細胞周期C-myc的基因的表達來發揮對心血管起保護作用。

〔關鍵詞〕菟絲子總黃酮;凋亡; Bcl-2/Bax; C-myc;血管平滑肌細胞

血管平滑肌增殖是引起高血壓、動脈粥樣硬化和血管成型術再狹窄等心血管疾病的主要發病機制。平滑肌細胞的增殖與凋亡失調，造成了平滑肌細胞數量的過度增加，內膜增厚、管腔變窄由此引起血管形態結構和功能改變，促發心血管疾病〔1〕。抑制血管平滑肌細胞異常增殖已成為當今治療血管增殖性疾病的主要途徑，也成為近幾年的研究熱點〔2〕。本研究觀察溫補腎陽的要藥有效部位——菟絲子總黃酮血管平滑肌細胞的保護作用，探討其對血管的保護作用機制。

1　材料和方法

1. 1藥物與儀器菟絲子經本院中藥鑒定教研室鑒定為Cuscuta Chinensis Lam的成熟種子，經溶劑提取，聚酰胺柱分離得總黃酮提取物，含量為85%〔3〕。DMEM培養基(美國Gibco)，新生小牛血清(杭州四季青生物公司); Trizol試劑、AMV試劑(大連寶生生物工程有限公司); Bcl-2、Bax一抗(Santa Cruz公司); Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術公司)。高速冷凍離心機(美國Sigma)，核酸蛋白分析儀(日本島津公司)，垂直電泳儀、轉移槽、梯度PCR儀(Bio-Red PTC 200)，凝膠成像系統(美國Sigma)，流式細胞儀(美國Becton Dinson公司FACScan)。Imago-pro plus 6. 0圖像分析軟件(美國冷泉儀器公司)。

1. 2主要方法和步驟

1. 2. 1血管平滑肌細胞的培養將SD大鼠胸主動脈用Hanks液沖洗去除殘余血液，剝去外膜，彎頭鑷子輕刮去內膜后剪成1 mm×1 mm的小塊，均勻涂布瓶壁，加入20%FCS的DMEM的培養基后，放置37℃、5%CO2將培養孵箱中培養1～2 h，將瓶緩慢翻轉平放，靜置培養。待2 w后，80%組織塊爬出的細胞融合。在倒置顯微鏡下，呈現平滑肌細胞典型的“峰”、“谷”樣生長和α-actin免疫組化法染色鑒定為血管平滑肌細胞〔4〕。

1. 2. 2實驗分組取P4～P6代細胞分為正常組(正常血管平滑肌細胞培養基);模型組(ox-LDL誘導血管內皮細胞損傷條件培養基，過氧化氫終濃度200 mmol/L);菟絲子總黃酮高劑量組(10 mmol/L+過氧化氫終濃度200 mmol/L);菟絲子總黃酮低劑量組(5 mmol/L+過氧化氫終濃度200 mmol/L)。取對數生長的第4代血管平滑肌細胞，以1×103個/孔細胞濃度接種于96孔培養板中，補液至100 μl，待細胞生長融合達50%時，換以含2% FBS DMEM培養液，37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，按實驗分組換液，每組設置5個復孔，置37℃、5%CO2培養箱中繼續培養48 h，換以含1 g/L MDMEM培養液，37℃孵育4 h，提取總RNA和蛋白。

1. 2. 3 RT-PCR測定C-myc mRNA表達Trizol一步法提總RNA，以蛋白核酸分析儀測定RNA濃度; M-MuLV逆轉錄酶催化合成cDNA;用Primer5軟件設計引物(正義鏈: CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG，反義鏈: AATTGTGCTGGTGCGTGGAC;β-actin:正義鏈: CCCATCTATGAGGGTTACGC，反義鏈: TTTAATGTCACGCACGATTTC); PCR擴增目的基因，反應條件: 94℃預變性5 min; 94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min(35個循環); 72℃延伸10 min。取5 μl PCR擴增產物于1. 5%瓊脂糖凝膠進行電泳，應用凝膠成像系統灰度掃描。膠片進行灰度掃描，以目的條帶的灰度值與β-actin條帶的灰度值的比值進行分析。

1. 2. 4 Westen印跡法測定血管平滑肌細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達根據蛋白提取液試劑盒說明書，提取細胞總蛋白，取少量用BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水浴5 min，取等量蛋白，10%SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，經TBST充分漂洗(10 min×3)，加兔抗人多克隆抗體(稀釋度: Bcl-2蛋白1∶500; Bax蛋白1∶300;β-actin 1∶1 000)4℃孵育過夜，充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋度為1∶1 000)室溫孵育2 h，洗滌后ECL增強化學發光顯色，β-actin作為內參照，凝膠圖像分析儀分析結果。

1. 2. 5 Annexin V-FITC法檢測凋亡平滑肌細胞用磷酸緩沖液(PBS)液離心洗滌2次，將離心沉淀的細胞加入冰70%乙醇固定，保存4℃冰箱24 h，將固定的單細胞懸液調至為1×106/ml的濃度。取1 ml細胞，1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清。重復3次。將細胞重懸于200 μl上樣緩沖液。加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，4℃反應30 min。加入300 μl上樣緩沖液，在1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1. 3統計分析采用SPSS16. 0軟件，進行單因素方差分析，兩兩比較方差齊時LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett T3檢驗。

2　結果

2. 1菟絲子總黃酮對動脈平滑肌細胞的凋亡影響菟絲子總黃酮高劑量組和低劑量組的死亡細胞數量比模型組明顯減少(P＜0. 05);高劑量組活細胞比模型組明顯增多(P＜0. 05)，低劑量組活細胞數量比模型組增多但無統計學意義(P＞0. 05);高劑量組和低劑量組晚期凋亡細胞數量比模型組沒有明顯增多(P＞0. 05)，高劑量組其早期凋亡細胞數量顯著減少，與模型組比較均有顯著差異(P＜0. 05)。其他細胞與模型組比較無統計學意義(P＞0. 05)，見表1。

表1　各組動脈平滑肌細胞的凋亡變化(x±s，%，n=6)

2. 2菟絲子總黃酮對血管平滑肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達影響模型組Bax蛋白表達升高和Bcl-2蛋白表達顯著下降，與正常組比較有統計學差異(P＜0. 05)。菟絲子總黃酮高劑量組Bax蛋白表達量下降與模型組比較有統計學差異(P＜0. 05)，而Bcl-2蛋白表達升高，但無顯著差異(P＞0. 05);菟絲子總黃酮低劑量組Bax蛋白表達量下降但無顯著性差異(P＞0. 05)，而Bcl-2蛋白表達量顯著性升高，與模型組比較有統計學差異(P＜0. 05);菟絲子總黃酮高、低劑量組之間無顯著差異，見表2和圖1。

表2　各組血管平滑肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達變化(x ±s，n=6)

2. 3菟絲子總黃酮對血管平滑肌細胞C-myc mRNA表達模型組C-myc mRNA表達(1. 07±0. 06)顯著下降，與正常組(1. 16±0. 08)比較有統計學差異(P＜0. 05)，菟絲子總黃酮高劑量組C-myc mRNA表達量(1. 11±0. 04)顯著升高，與模型組比較有統計學差異(P＜0. 05)，菟絲子總黃酮低劑量組C-myc mR-NA表達量(1. 13±0. 05)顯著升高，與模型組比較有統計學差異(P＜0. 05)，但菟絲子總黃酮高、低劑量組無顯著差異(P＞0. 05)，無劑量依從效應。

圖1　各組Bcl-2和Bax蛋白變化

3　討論

細胞凋亡是多種基因參與的復雜分子調控機制，Bcl-2原癌基因是目前最受關注的凋亡相關基因之一，通過編碼Bcl-2蛋白而發揮抗凋亡作用。Bcl-2蛋白可以通過抗氧化作用減少氧自由基的產生和脂質過氧化物的形成。還可以通抑制細胞膜通道的形成，穩定線粒體膜電位，而阻止細胞色素C從線粒體中的釋放，保護細胞膜穩定細胞〔5〕。Bcl-2蛋白的BH3結構域與促凋亡Bax，Bak基因形成異二聚體，從而維持促凋亡成員在細胞內的定位分布，保護細胞不進入凋亡程序〔6〕。

體內外實驗均發現氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)促進血管平滑肌細胞的凋亡。ox-LDL將平滑肌細胞阻滯在G2/M期從而誘導其凋亡，是通過調節細胞G蛋白偶聯受體，與Ras/Raf/MEK/MAPK通路有關〔7〕。本實驗提示其能促進平滑肌細胞的凋亡，菟絲子總黃酮能改善抗凋亡和促凋亡蛋白失衡。

溫補腎陽的中藥——菟絲子具有對實驗性大鼠心肌缺血有明顯的預防和治療作用，可減輕心肌缺血的程度和范圍，并且增加冠狀動脈流量、擴冠、降壓以及強心等作用〔8〕。本課題組前期研究表明，菟絲子總黃酮有促進機體內源性雌激素的產生，菟絲子總黃酮高、低劑量能明顯降低血脂中TG水平，能提高主動脈平滑肌細胞的雌激素受體陽性表達，提示菟絲子總黃酮通過調整血脂代謝、增加內源性雌激素水平及增加血管平滑肌雌激素受體發揮其對血管的保護作用〔9〕。

C-myc基因是細胞進化過程中保守的癌基因家族myc基因家族的重要成員之一，3個外顯子和2個內含子組成，編碼49 kD核內磷酸化的蛋白質，以調節基因轉錄。既是一種可使細胞無限增殖，促進細胞分裂的基因，也是調控細胞凋亡基因，可以誘導除去生長因子的平滑肌細胞和成纖維細胞發生凋亡。用C-myc與Bcl-2共同轉染血管平滑肌細胞時，則誘導血管平滑肌細胞凋亡的活性被抑制〔10〕。本研究中菟絲子總黃酮可能通過升高C-myc基因表達，阻止血管平滑肌細胞凋亡。血管平滑肌凋亡效應是多個通路相互協調，形成一個信號網絡共同完成的。本實驗菟絲子總黃酮僅對抑制血管平滑肌細胞凋亡的分子機制做初步的探討，對具體信號通路的影響尚有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2014-06-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者:謝斌(1975-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中醫藥防治心血管疾病研究。

基金項目:江西省自然基金課題(2008GZY0018)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5742-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 026

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R285

第一作者:王曉敏(1972-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中醫藥防治心血管疾病研究。