體內藥物分析學生實驗中藥物血樣測定方法的優選與比較

摘要：本文優選了藥學本科生中有關體內藥物分析的具體實例，探討了實驗方法的可行性，并對測定方法進行優化與比較。采用蛋白沉淀法進行樣品前處理；紫外檢測器與熒光檢測器同時定量測定，比較兩種不同檢測方法的抗干擾能力與信號響應強度的差異，優化實驗條件。與原先設計的實驗相比，本實驗可操作性強，血藥濃度方法簡單、準確。而且可以使學生在復雜樣品測定方法選擇時有更好的感性認識、提高實驗教學效果，強化所學基礎知識的實際應用。為適應今后工作打下堅實的基礎。

關鍵詞：高效液相色譜法；氧氟沙星；體內藥分學生實驗

中圖分類號：G642.41 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）48-0275-03

體內藥物分析是一門研究生物機體中藥物及其代謝物和內源性物質的質與量的變化規律的分析方法學。體內藥物分析直接關系到藥物研制、藥物臨床試驗與使用、藥物作用機制探討、藥物質量評價等各階段的工作。它在探求科學用藥規律與安全、有效、合理用藥、開發新藥、保障人類健康方面具有重要作用。

對體內藥物進行研究時，要求分析方法的靈敏度、專屬性和可靠性的程度均較高，建立有效的分析方法是體內藥物分析的首要任務。其次，在新藥研究過程中，按照國家新藥注冊審批有關規定，要提供藥物在動物和人體內的藥物動力學參數、生物利用度及血漿蛋白結合率等基本數據，這些研究工作要靠體內藥物分析來完成。再者，為保證臨床用藥安全有效，體內藥物分析也應為治療藥物監測提供準確的血藥濃度測定值，并對血藥濃度進行具體分析和合理解釋，提供藥學情報和信息，參與指導臨床合理用藥確定最佳劑量、制訂治療方案。

建立準確、可靠的生物樣品分析方法是進行體內藥物分析的基礎。體內樣品大都采樣量少、待測藥物濃度低、干擾物質多，因此體內藥物分析的特點是體內樣品測定前須經分離與濃集，并且對定量分析方法的靈敏度和專屬性要求較高。體內樣品分析包括兩部分，一部分為前處理方法的選擇和優化，包括蛋白沉淀、液液提取、固相萃取等；第二部分為定量測定方法包括色譜法、免疫分析法等，其中高效液相色譜法因其專屬性強、準確度好而在體內藥物分析中發揮著最為重要的作用。

為培養學生獨立思考能力和解決問題的能力，鞏固和加強對所學知識的認識，我們將原來體內藥物分析實驗課程選用的實驗“血漿中水楊酸的HPLC測定”改為“血漿中氧氟沙星的HPLC法測定”[1-4]。氧氟沙星具有強的熒光吸收，而水楊酸只有紫外吸收，將水楊酸換成氧氟沙星，同時采用兩個檢測器采集數據，根據兩種檢測器中的樣品出峰情況，學生可以直觀地對檢測方法進行專屬性和靈敏度的比較，鞏固課堂上關于藥物結構與分析方法選擇的相關知識。為學生今后科研工作提供有益參考，對于提高學生的藥學專業素質有著至關重要的作用。

一、實驗內容

1.實驗藥物：氧氟沙星標準品，氧氟沙星膠囊。

2.實驗動物：雄性大鼠，體重250g左右，由復旦大學藥學院實驗動物中心提供。

3.實驗方法。①給藥方案：按80mg/kg劑量一次性大鼠灌胃氧氟沙星，灌胃后1.5小時取大鼠血樣于預加肝素試管中，2500轉/分鐘離心10分鐘，吸取上層血漿于試管中，-18℃冰箱冷凍保存。②儀器條件：日本HITACHI公司L-2000型高效液相色譜儀，含四元泵（L-2130）、柱溫箱（L-2300）、自動進樣器（L-2200）、二極管陣列檢測器（L-2455）和D-2000工作站。色譜分析條件：色譜柱：C18柱，200mm×4.6mm（ID），5m。柱溫：30℃。流動相：0.5%三氟乙酸水溶液：甲醇=60：40；紫外檢測：檢測波長296nm；熒光檢測：激發波長296nm，發射波長498nm；流速：1.0mL/min③氧氟沙星標準溶液的配制：精密稱取氧氟沙星標準品5.16mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，藥物濃度為0.509mg/mL（標準品含量98.6%），作為貯備溶液。精密量取貯備溶液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為508.8μg/mL、50.88μg/mL和5.09μg/mL的溶液。④血樣處理：精密移取血漿0.2ml，置1.5ml塑料離心管內，加入10%高氯酸溶液0.1mL，旋渦2min后，16000rpm離心10min，取上清液20l進樣作HPLC分析。外標法定量。

二、實驗結果

1.專屬性考察。在此色譜條件下，氧氟沙星與血漿中內源性雜質均完全分離，峰形尖銳，其保留時間約為4.2分鐘，其他均為內源性雜質。考察了6份不同來源的大鼠血漿，在所建立的HPLC條件下進行分析，典型色譜圖如圖1～2。其中圖1為空白血漿色譜圖，圖2為含藥血漿色譜圖，圖中a為熒光檢測器信號；b為紫外檢測器信號。從圖中可以看出紫外檢測器中雜峰明顯偏大，而且在藥物信號窗附近有干擾；熒光檢測器時血漿中的內源性雜質不干擾并且氧氟沙星的色譜峰遠遠高于紫外檢測器中的響應。

2.熒光檢測器檢測的標準曲線與線性范圍。取若干只1.5mL塑料離心管，各加入空白血漿0.5mL，加入氧氟沙星對照品溶液，使其濃度分別為0.020、0.051、0.102、0.204、0.509、1.018、2.036、5.088和

10.176μg/mL，每個濃度三管，再按“血樣預處理”項的方法操作后，作HPLC分析。以樣品峰面積（Y），對藥物濃度（C，μg/mL）進行線性回歸，計算結果為Y=820.5506C-73.2914（r=0.9992，n=9）。線性范圍：0.0210μg/ml。

3.精密度。配制高、中、低三個點（0.05、0.5和5μg/mL）的標準血樣各6份，于同一天按血樣預處理的方法操作后進樣20μL，作HPLC分析，計算批內精密度。連續測定三批樣品作批間精密度試驗。結果為低、中、高濃度的天內精密度RSD分別為5.53%、2.25%及1.17%。批間精密度RSD分別為5.22%、3.28%及1.91%。endprint

4.方法回收率。取大鼠空白血0.5mL若干，分別加入氧氟沙星對照品溶液，使其濃度分別為0.05、0.5和5g/mL，再按“血樣預處理”項的方法操作后，作HPLC分析。將藥物峰面積代入標準曲線的方程中，計算所得的濃度除以理論濃度，即得方法回收率，結果分別為103.96±4.16%、100.58±1.91%及100.02±1.16%。

5.提取回收率。取大鼠空白血漿0.5ml數份，分別加入氧氟沙星標準溶液使血漿中氧氟沙星的濃度分別為0.05、0.5和5μg/mL，同法用水代替血漿制備三個濃度樣品，每個濃度做三份，按血樣預處理后作HPLC分析，記錄峰面積。計算提取回收率。結果分別為88.75%±1.58、93.92%±6.37及91.70%±2.01。

6.定量限。取大鼠空白血漿0.5mL，精密加入氧氟沙星標準品溶液，使其濃度為0.01μg/mL，再按“血樣預處理”項的方法操作后，進樣20μL，血樣最低定量濃度熒光檢測器為0.02μg/mL、紫外檢測器為0.2μg/mL。

三、討論

1.樣品預處理方法的選擇。本實驗的樣品預處理方法為沉淀蛋白法，操作極為簡單，引入誤差小，樣品的取用量少。而原先樣品預處理方法為有機溶劑提取法，方法操作煩瑣，在處理過程中樣品容易發生乳化而導致樣品損失；另外采用液液提取法血漿樣品取用量大，實際操作性差，同時實驗成本較高。

2.測定方法的選擇。本實驗中我們開發了測定大鼠血漿中氧氟沙星的高效液相色譜測定方法，該方法靈敏、專屬、準確性高，血藥濃度測定準確。選擇具有紫外及熒光吸收的藥物進行HPLC分離后熒光與紫外同時檢測，通過兩種檢測器檢測結果比較，使學生掌握以藥物結構為依據進行定量方法選擇這一重要思路，為學生今后科研工作提供有益參考。

經本校多個年級本科生的實驗教學證明，該實驗方法操作性強、實驗方法簡單直觀、測定結果準確，大大提高了學生對教學內容的認識，達到了較好的實驗教學目的。

參考文獻：

[1]劉芳群，魯虹.高效液相色譜法測定人血漿中左氧氟沙星的濃度[J].中南藥學，2012，10（10）：734-736.

[2]李濤，左氧氟沙星人體血藥濃度測定及藥代動力學分析[J].吉林醫學，2011，32（27）：5725-5726.

[3]郝曉花，蔣曄，謝贊，劉紅菊，郝福.RP-HPLC測定血清中氧氟沙星的濃度[J].華西藥學雜志，2006，21（2）：192-193.

[4]萬慧杰，唐星.氧氟沙星緩釋膠囊家犬體內藥動學及相對生物利用度[J].中國新藥雜志，2006，15（17）：1458-1460.

作者簡介：梁建英，女，副教授，碩士生導師，復旦大學藥學院，藥物分析學教研室。endprint