溴結構域蛋白44在腫瘤中的研究進展△

仝營營 丁文評 張蓮 金星鏡 陳思宇

上海交通大學附屬新華醫院腫瘤科，上海 200092

溴結構域蛋白4（Brd4）是溴結構域和超末端結構（bromodomain and extraterminal domain，BET）家族成員，其中含有兩個溴結構域和一個超末端結構，在整個細胞周期中通過溴結構域結合乙酰化的組蛋白。Brd4通過招募不同的轉錄調節因子，如Mediator、正性轉錄延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）來調節靶基因的表達。其在調節細胞基因轉錄、細胞周期、炎癥等生物過程中發揮重要作用。另外，最近的研究表明Brd4的表達水平失調或功能紊亂與睪丸核蛋白中線癌（midlinecarcinomawith rearrangement of thenuclear protein in testisgene，NMC）、黑色素瘤、急性髓系白血病、結腸癌、乳腺癌等的發生有關，它參與上皮間質轉化、干細胞樣轉化過程。Brd4 shRNA或BET抑制劑可以誘導上述腫瘤發生細胞周期阻滯、凋亡及細胞分化，顯示出強大的抗腫瘤活性。這些發現表明，BET蛋白有望成為上述腫瘤甚至其他腫瘤新的治療靶點。本文主要闡述Brd4在不同類型腫瘤生物學過程中的作用。

1 BET家族及Brd4

溴結構域蛋白（bromodomains protein）存在于很多核調節因子中，其序列多變，但都攜帶一個保守的折疊結構，該結構由4個左手α螺旋（αZ、αA、αB和αC）構成[1]，可以特異性地識別ε-N-乙酰化賴氨酸殘基，在招募基因轉錄因子等到乙酰化的染色質過程中發揮重要作用[2-3]。Brd功能紊亂與很多疾病的發生有關，特別是與腫瘤的發生關系尤為密切[4]。人體基因組編碼超過50個溴結構域蛋白，從系統發生的角度可將這些蛋白分為8個亞家族。BET是其中的一個特殊群體，攜帶兩個串聯溴結構域（BDⅠ、BDⅡ）和一個ET結構域[5]，主要調節細胞增殖和細胞周期進程。黑腹果蠅的Fsh是已知的最古老的BET家族成員[6]。在釀酒酵母中，BET家族有Bdf1和Bdf2兩個成員。兩者結構相似，其中Bdf1是一種通用轉錄因子，介導酵母基因轉錄過程。基因分析表明，Bdf1還參與調控細胞生長和染色體重塑[7]。如果破壞Bdf1和Bdf2其中之一，并不會對酵母產生很大影響，但兩者同時失去功能則會使酵母無法生存[8]。

在哺乳動物中，BET家族由Brd2、Brd3、Brd4和Brdt四個成員組成，它們具有相似的結構域。Brd2以前也稱Ring3/frgs1，是一種有激酶活性的轉錄調節因子[9-10]。Brd3（也稱為ORFX/fshrg2）和Brdt的報道較少。有研究表明，在小鼠中，Brdt通過乙酰化途徑來影響染色質的構型[11]。Brd4，起初被稱為MCAP（mitotic chromosome-associated protein），又被稱為Fshrg4和Hunk1，它是一種特殊的染色體結合因子，不同于一般的核轉錄調節因子，可以在整個有絲分裂過程中始終結合到染色體上[12]。正常情況下，Brd4基因有兩種不同的剪切形式，編碼形成不同的亞型——短亞型和長亞型。長亞型Brd4具有2個BD結構域（BDⅠ、BDⅡ）、1個ET結構域、1個富含絲氨酸的SEED結構域和富含脯氨酸的C-末端區；較短的亞型保留具有結合染色質作用的BD結構域，但是缺乏結合P-TEFb的區域及富含脯氨酸的結構域[13]。

2 Brd4的生理功能

Brd4可以結合乙酰化組蛋白H3 Lys-14、H4 Lys-5/8/12，并招募其他的染色質修飾蛋白，從而誘導細胞的靶基因活化或抑制[14]；還可以結合乙酰化的非組蛋白，如γ皰疹病毒f73蛋白、NF-κB亞基Rel A等，來調控DNA復制、細胞周期、基因轉錄等其他細胞活動[15]。

2.1 Brd4在細胞周期中的作用

Brd4可以在細胞周期的不同時期發揮作用，具有復雜的生長調節活性。其表達水平可以被生長刺激信號上調或被生長抑制信號下調。在Brd4+/-雜合子細胞中，組蛋白H3的Lys-14和H4的Lys-12乙酰化水平降低，這表明Brd4可能在保持細胞染色質的普遍乙酰化狀態方面發揮作用[16]。

在哺乳動物細胞的有絲分裂期，一些轉錄因子和調節蛋白從染色體上分離，如Sp1、CBP和一些溴結構域蛋白等，這與該時期的轉錄抑制相吻合。而在分裂期，Brd4仍結合在染色體上，這是Brd4最顯著的特征。Maruyama等[17]的研究表明，Brd4在整個細胞周期均表達，Brd4在G1期表達下調有利于細胞向S期轉化。Brd4過表達可以使正常細胞和腫瘤細胞發生G1/S期阻滯。Brd4的BDⅡ結構域，至少有一部分是通過與復制因子C（replication factor C，RFC）的亞基RFC-140相互作用而抑制RFC的功能，進而使細胞發生G1/S期阻滯。其中任何一個的水平或活性異常便可破壞Brd4與RFC之間的平衡狀態，從而影響細胞周期進程。通過微陣列分析發現，與對照細胞相比，用Brd4 shRNA敲除Brd4后，細胞G1期的基因表達未增加，并且細胞生長減慢，發生G1期阻滯。重新表達Brd4可以挽救這些G1期基因的表達，并使細胞發生G1/S期轉化。染色質免疫共沉淀測序分析表明，Brd4在G0～G1期被招募到G1期基因的啟動子上，調節這些基因的轉錄，從而促使細胞向G1/S期轉化。Brd4主要結合到含有常染色質和較少異染色質的區域，向增生細胞注射微量的Brd4抗體，會使細胞發生G2/M期阻滯。cyclinB-cdc2復合物結合到染色體上，是決定細胞是否進入到M期的關鍵，Brd4可能通過調節cyclinB-cdc2的活性以發揮其阻滯G2/M期轉化的作用[18]。因此，Brd4在調節細胞周期進程中扮演重要的角色。

2.2 Brd4介導基因轉錄調控

近年的研究發現，在很多轉錄復合物中存在Brd4，包括通用輔助因子Mediator和P-TEFb，并且它能夠以不依賴Tat的方式激活HIV的轉錄。另外，不同類型的HPV以Brd4作為適配器把病毒基因組錨定在宿主有絲分裂染色體上。Brd4與病毒編碼的E2蛋白相互作用，有利于病毒基因組在有絲分裂過程中的分離。在HPV E2沉默復合物中也存在Brd4，E2沉默復合物可以抑制具有拮抗抑癌基因p53和pRB功能的E6、E7的表達。Brd4基因的活化或抑制轉錄的雙重作用表明，Brd4可以招募不同的轉錄調節因子來調節啟動子的活性。

利用人類細胞蛋白質與小鼠來源的Brd4進行免疫共沉淀時，Brd4可以與cyclin T1、CDK9、Mediator相互作用[19]。值得注意的是，Brd4僅存在于含有cyclin T1和CDK9的有活性的P-TEFb復合物中，而不出現于含有HEXIM1和7SK小核RNA的無活性的P-TEFb復合物內。在正常細胞中，兩種活性的P-TEFb復合物等量存在[20]。Brd4與P-TEFb的相互作用提示Brd4可能參與了RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）介導的基因轉錄。Brd4確實可以刺激一些基因的表達，如C-Myc和C-Jun，還可以增強CDK9介導的PolⅡ的C-末端結構域（CTD）的磷酸化；去乙酰化酶抑制劑可以使Brd4招募更多有活性的P-TEFb復合物到啟動子附近的乙酰化染色質，來促使PolⅡ介導的轉錄[19]。這些研究表明，Brd4在PolⅡ介導的轉錄過程中發揮了多重作用。此外，在有絲分裂過程中，核心組蛋白乙酰化程度降低，除Brd4、Brd2外，大量的轉錄調節因子被釋放到胞質中導致轉錄抑制。然而，在此過程中，有些H4、H3仍保持乙酰化的狀態，這可能與Brd4、Brd2的作用有關，該現象表明溴結構域蛋白可能在向子細胞傳遞轉錄記憶方面發揮重要作用[12]。

3 Brd4在腫瘤發生、發展中的作用

Brd4在不同組織中調控細胞周期進展和細胞分化。近年的研究發現，其在細胞惡性轉化和腫瘤的進展中也具有重要作用，可能還參與腫瘤細胞的浸潤和轉移等過程。許多血液系統惡性腫瘤，如多發性骨髓瘤、急性髓系白血病，以及乳腺癌、結腸癌和肺癌等均與Brd4功能紊亂有關。

3.1 Brd4與NMC

NMC是一種高度侵襲性的鱗狀細胞癌，以獲得性染色體重排為特點，常涉及NUT基因，形成Brd4ˉNUT融合基因，也可以與未知的基因或Brd3形成 NUTˉvariant融合基因[21-22]。大約有 2/3 的NMC患者具有互惠的染色體易位t（15q14，19p13.1），形成 Brd4ˉNUT融合癌基因，其表達受Brd4的啟動子控制。在正常情況下，NUT僅表達于減數分裂后的精子細胞中，是一種無結構的多肽，但是含有兩個酸性的、潛在的蛋白結合結構域（AD1、AD2）。AD1可以結合并活化組蛋白乙酰轉移酶P300（HAT），這導致精子細胞發生全局性的組蛋白乙酰化，隨后染色質濃縮[23]。在正常細胞中，NUT蛋白以出核因子CRM1依賴的方式在細胞質與細胞核間穿梭，然而，Brd-NUT融合蛋白在整個細胞周期中一直結合在染色質上。由此可見，在NMC中，Brd4、Brd3可能在栓系NUT到染色體方面發揮作用[24]。

敲除 Brd4ˉNUT 或 Brd3ˉNUT，NMC 細胞中與鱗狀分化相關的蛋白增加，如胞質角蛋白和外皮蛋白，并且核體積增大、核常染色質增多。隨著時間的延長，這些細胞停止生長并且分化為圓形的、靜止的鱗狀細胞[24-25]。敲除BrdˉNUT融合蛋白基因的反應表明，Brd-NUT融合蛋白是一種重要的致病因素，它是阻滯腫瘤細胞分化的作用因子，應該突出針對這些蛋白為治療靶點的重要性。

Brd4-NUT與乙酰化的染色質和P300的關系表明，Brd4-NUT可以改變細胞全局組蛋白的乙酰化狀態，但是，它不是增加而是降低組蛋白的乙酰化狀態，這種改變與很多基因表達水平降低相關。因此，提出一個假設：Brd-NUT隔絕了HAT或者表達終末鱗狀分化相關基因所需的其他因子的活性[25]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑或者BET抑制劑，后者可抑制Brd-NUT融合蛋白結合到染色體，誘導NMC細胞終末分化。這為對常規化療和放療耐藥的NMC靶向治療提供了理論依據。

3.2 Brd4與血液系統腫瘤

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一種干細胞衍生的造血系統惡性腫瘤，以在骨髓、血液和其他器官中惡性增殖和原始粒細胞增多為特征。AML在遺傳學和生物學水平具有高度異質性，是基因和表觀遺傳改變導致腫瘤發生的最好例證。2011年，Zuber等[26]通過篩選自定義文庫中243種已知的針對染色質調節因子的shRNA，包括大多數表觀遺傳標記的“writers”、“readers”和“erasers”，發現 Brd4是維持由MLL-AF9和NrasG12D驅動的AML的重要因子。在體內外，用shRNA或者小分子BET抑制劑JQ1抑制Brd4具有穩定的抗白血病作用，包括終末骨髓分化和白血病干細胞的消除。最近的研究表明，Myc轉錄參與白血病干細胞的自我更新[27]。shRNA或者JQ1抑制Brd4可導致MLL-AF9/NrasG12D白血病細胞的Myc mRNA和蛋白水平明顯下降，并且這發生在巨噬細胞分化基因（如Cd74）的表達增加之前。染色質免疫共沉淀實驗顯示，Brd4結合到Myc啟動子上游2 kb的位置，JQ1使兩者的結合消失，這為Brd4調控Myc的轉錄提供了直接證據。異位表達Myc cDNA幾乎完全阻止JQ1、Brd4 shRNA誘導的細胞形態變化及細胞周期阻滯。這說明抑制Brd4至少是通過下調具有促進異常自我更新作用的Myc的表達而發揮部分作用；然而，異位表達Myc不能阻止JQ1誘導的細胞死亡，說明Brd4還可以通過不依賴Myc的途徑調節AML細胞的生存。

與對MLL融合的AML細胞系的作用相似，BET抑制劑也可以誘導不同的非MLL融合的AML細胞系發生凋亡及G0/G1期阻滯[28]。Dawson等[29]用三個獨立的蛋白質組學方法發現，HL60細胞中Brd4與一部分野生型NPM1相互作用，發現在AML患者的腫瘤樣本中部分Brd4與野生型NPM1有共定位。先前已證明突變型NPM1（NPM1c）誘導過量的NPM1到細胞質[30]。但是在NPM1突變的OCI-AML3細胞中，大多數的Brd4仍位于細胞核。因此，Dawson等認為，NPM1-Brd4相互作用抑制兩者形成的復合物中Brd4的轉錄活性，位于細胞質的NPM1無法發揮抑制Brd4的轉錄活性，從而導致基因異常表達。用CRM1抑制劑LMB恢復NPM1-Brd4的相互作用，可使依賴Brd4的基因表達下調，如Bcl2和CMyc，該結果支持上述推理。這些研究闡明了NPM1c AML的發病機制，并且為BET抑制劑治療多種AML亞型提供了前期理論依據。

Brd4是治療血液病的一個良好靶點。BET抑制劑對多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤同樣具有高效的抗腫瘤活性[31-33]。BET抑制劑可下調一組基因的表達，這些對BET抑制劑敏感的基因多具有超級增強子。發生機制可能是BET抑制劑干擾了Brd4與腫瘤細胞中的超級增強子的結合，從而抑制了一組基因的轉錄，包括Bcl2、C-Myc等，進而發揮其抗腫瘤活性的作用。

3.3 Brd4與乳腺癌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。Hunter等[34-35]利用遺傳學、功能基因組學和全基因組表達分析的綜合方法，發現Brd4或Brd4相關通路可能在小鼠和人類的乳腺癌進展中發揮重要的作用。體外實驗表明活化的Brd4可降低高侵襲小鼠乳腺腫瘤細胞的轉移和運動能力，但不影響其增殖能力。但是，將同樣的腫瘤細胞種植到裸鼠，表達Brd4的小鼠則較少發生腫瘤轉移。并且與細胞實驗不同的是，小鼠腫瘤的體積也較小。研究人員推測，這種活體實驗中腫瘤大小的差異可能反映了Brd4對腫瘤微環境的影響力。

為了闡釋Brd4在乳腺癌侵襲易感性方面的作用機制，有研究[36]采用亞型和結構域分析的方法發現，刪除Brd4的BD不會對Brd4促進乳腺癌轉移的能力產生影響；表達自然截短的Brd4可恢復其促進腫瘤進展和轉移的能力；刪除長亞型Brd4富含脯氨酸的區域，可誘導細胞間充質樣轉化和獲得癌干細胞樣特性（該變化是由羧基末端的P-TEFb結合區域介導的），并且刪除富含脯氨酸的結構域可誘導表達更差的預后基因標簽，該表達標簽與人類G3級乳腺癌組織的基因標簽重合。同時，長亞型Brd4含有抑制（富含脯氨酸結構域）和促進（P-TEFb結合區域）乳腺癌侵襲轉移的作用，短亞型Brd4無富含脯氨酸結構域，只具有促進侵襲轉移的能力。但是，這些結構域發揮作用的具體機制仍需更深入的研究。因此，可以推測短亞型可能與長亞型競爭結合乙酰化的組蛋白，從而干擾長亞型的功能，乳腺癌的轉移易感性取決于兩種亞型的比例。這些結果表明，Brd4介導的腫瘤轉移易感性是促進與抑制雙重作用的綜合結果，進一步研究Brd4調控的靶點有可能揭示乳腺癌上皮發展及惡性進展相關的重要過程。

3.4 Brd4與其他腫瘤

Brd4識別乙酰化的染色質并招募不同的因子，作為染色質的“適配器”調控很多基因的表達。由于其廣泛的生物學功能，Brd4不僅與上述腫瘤有關，還與很多其他腫瘤密切相關。在肺癌中，Brd4結合FOSL1的增強子調節FOSL1的表達，FOSL1與JUN家族形成二聚體來調節AP-1靶基因的表達。BET抑制劑可以通過影響Myc轉錄過程來抑制惡性血液病細胞系的周期進程。但是，在肺腺癌中，BET通過與FOSL1而非Myc的相互作用來誘導細胞周期阻滯[37]。在人類結腸癌細胞系和原發性腫瘤中，啟動子異常的高甲基化導致Brd4表達下調，重新異位表達Brd4可以明顯抑制腫瘤生長，這表明Brd4在人類結腸癌中扮演重要角色。另外，在甲基化狀態正常的結腸癌細胞系中，Brd4水平仍然比正常細胞低，這說明還有其他機制調節Brd4的表達，如組蛋白乙酰化狀態、組蛋白甲基化狀態[38]。但是，黑色素瘤細胞系中Brd4擴增及表達水平卻增高，敲除Brd4或BET的小分子抑制劑導致大多數的黑色素瘤細胞系發生G1期阻滯及分化更好的形態學改變[39]。總之，在不同細胞中，Brd4調控的靶基因可能不同，使得其抑制劑在不同腫瘤中發揮的作用也不同。

4 B E T抑制劑

近年來，越來越多的學者開始采用以調控表觀遺傳和維持腫瘤細胞特性的轉錄過程為靶點的治療策略。BET蛋白是在染色質重塑和轉錄調節過程中發揮重要作用的表觀遺傳“readers”，隨著對BET蛋白功能認識的不斷深入，探索靶向抑制Brd展示的抗腫瘤活性正成為研發抗腫瘤藥物的新途徑。根據化學結構，將強效BET抑制劑分為3 類：異惡唑類、酰胺/脲類和 1’2’4-三唑類[40]。IBET-762、JQ1是常見的BET抑制劑，它們抑制BET蛋白與乙酰化組蛋白的結合[41-42]。BET抑制劑已經顯示出強大的抗腫瘤活性，I-BET-762治療NMC的Ⅰ期臨床試驗正在進行（NCT01587703）。研究BET抑制劑，為腫瘤的治療提供了新途徑。以表觀遺傳為基礎來治療腫瘤需解決的一個重要問題便是藥物的非特異性，盡管BET抑制劑可能具有較高的特異性，但BET蛋白與很多基因調控過程有關，且具有組織特異性。學者們可以預測這些化合物的毒性，但脫靶效應的機制尚未闡明。目前只是初步了解BET靶點的潛在治療價值。

5 小結與展望

綜上所述，Brd4異常會導致很多基因表達失調，與腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡、侵襲轉移等過程有關，其在腫瘤的發生、發展過程中具有至關重要的作用。此外，以Brd4為靶點的治療顯示出強大的抗腫瘤活性。然而，關于Brd4的研究仍然有許多問題亟待解決。雖然研究已經證實，許多基因（如CˉMyc、FOSL1等）為Brd4的靶基因，但Brd4有更多的靶基因尚未被發現。因此，現有的研究結果還不能完全闡明Brd4在腫瘤進展中的全部作用，Brd4的確切作用機制有待進一步研究。但是，相信隨著研究的不斷深入，這些問題終將被解決，Brd4必將成為治療腫瘤的新靶點。

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