鞘堿性蛋白活化的SD大鼠T細胞培養與鑒定

趙 皓，余 晾，張敬星，陳月娟，呂合作，，王保龍

鞘堿性蛋白活化的SD大鼠T細胞培養與鑒定

趙 皓1，2，余 晾2，張敬星3，陳月娟3，呂合作2，3，王保龍1

目的培養針對髓鞘堿性蛋白（MBP）特異的SD大鼠T淋巴細胞，對其表型和細胞因子分泌特征進行鑒定。方法將MBP免疫SD大鼠，收集回流淋巴結，制備成單細胞懸液，在RMPI 1640培養液中用MBP反復刺激獲得MBP特異性T細胞（MBP-T）。然后用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法測定其對MBP刺激的反應性，用流式細胞術鑒定其表型和細胞因子的產生。結果當MBP抗原存在的情況下，MBP-T的3H-TdR摻入量明顯增加。流式細胞術檢測表明MBP-T主要為CD3＋CD4＋的T淋巴細胞（98%），并可以產生干擾素γ（IFN-γ）和白細胞介素10（IL-10）等細胞因子。結論MBP免疫SD大鼠的回流淋巴結細胞，經過體外擴增可以獲得MBP特異性的T細胞，其表型主要為CD3＋CD4＋，并可以產生Th1和Tr1型細胞因子。

髓鞘堿性蛋白；淋巴細胞；免疫；流式細胞術

傳統觀點認為中樞神經系統（central nervous system，CNS）是一個免疫豁免區，CNS抗原如髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）與免疫系統在解剖學上處于隔離狀態，被稱為隱蔽抗原［1－2］。因而，長期以來一直認為CNS損傷后的自身免疫反應會加重繼發性損害，不利于神經保護和神經再生［3－4］。然而，以色列Schwartz et al［5］研究小組卻提出CNS“保護性自身免疫”學說。該學說認為CNS損傷后的自身免疫反應除具有加重繼發性損傷的負面作用外，也具有神經保護和促進神經再生的積極作用，只是在自然狀態下，這種作用過于微弱，被其負面作用壓制而難以表現。采用一些免疫干預的手段，如用體外擴增的MBP特異性T細胞（myelin basic protein specific T cells，MBP-T）進行過繼免疫則可以激發這種神經保護作用［6］。因此，該研究擬采用MBP免疫SD大鼠，獲取回流淋巴結，再通過反復刺激的方法體外擴增MBP特異的T細胞，然后采用流式細胞術檢測其表型和細胞因子分泌特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5只健康成年清潔級SD大鼠，220～250 g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。動物實驗和護理均按照美國國家研究委員會1996年制定的《實驗動物護理和使用指南》及蚌埠醫學院動物保護和使用委員會制定的《嚙齒動物生存手術的方針政策》執行。

1.2 主要試劑與儀器完全福氏佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）（美國BBI公司）；MBP、刀豆蛋白A（concanavalin A，conA）、絲裂霉素C、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、Monesion（美國Sigma公司）；RMPI 1640（美國Gibco公司）；谷氨酰胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二巰基乙醇、丙酮酸鈉（中國華美公司）；慶大霉素（上海中西制藥有限公司）；Ficoll淋巴細胞分離液（上海試劑二廠）；復方泛影葡胺（上海淮海制藥廠）；重組人IL-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）（長春長生基因藥業公司）；100×Glutamine、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、漢克斯平衡鹽溶液（hank′s balanced salt solution，HBSS）（Ca2＋，Mg2＋free）（美國Invitrogen公司）；3H-胸腺嘧啶（3H-thymidine，3H-TdR）（北京原子能股份有限公司）；戊巴比妥鈉（上海化學試劑采供站進口分裝）；FITC標記的CD3單克隆抗體（FITC conjugated anti-CD3 mAb，CD3-FITC）、PE標記的CD4單克隆抗體（PE conjugated anti-CD4 mAb，CD4-PE）、APC標記的CD8單克隆抗體（APC conjugated anti-CD8 mAb，CD8-APC）（美國Caltag laboratories）；FITC標記的IFN-γ抗體（FITC conjugated anti-IFN-γ，IFN-γ-FITC）（美國Harlan公司）；PE標記的IL-10抗體（PE conjugated anti-IL-10，IL-10-PE）、FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；eFluor?660標記的IL-4抗體（eFluor?660 conjugated anti-IL-4，IL-4-eFluor?660）（美國eBioscience公司）。

1.3 MBP-T的培養與擴增將MBP溶于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）配成1 mg／ml的濃度，與等量的CFA（4 mg／ml熱滅活的結核桿菌）混合，置2只注射器中來回抽推制成MBP／CFA油包水乳劑，4℃保存備用。將0.2 ml MBP／CFA乳劑注射于SD大鼠雙側后足跖真皮內進行免疫。免疫9 d后，無菌取大鼠腹股溝淋巴結，制備成單細胞懸液，用RMPI 1640洗2次后，用刺激培養基（RMPI 1640添加L-谷氨酰胺2 mmol／L、二巰基乙醇50 μmol／L、丙酮酸鈉1 mmol／L、Hepes 10 mmol／L、慶大霉素50 000 IU和體積分數為2%的同基因SD大鼠血清）調細胞濃度至1×107／ml，加MBP（25 mg／L）于37℃5%CO2培養箱中培養3 d，刺激MBP特異的T細胞，使之活化。培養3 d后，收集細胞，室溫離心（1 000 r／min，10 min）取沉淀，用2 ml RMPI 1640液重懸細胞。用3 ml Ficoll淋巴細胞分離液（用泛影葡胺調密度至1.088）于1 500 r／min離心30 min后分離活化的T細胞母細胞。用增殖培養基（RMPI 1640添加2 mmol／L L-谷氨酰胺、50 μmol／L二巰基乙醇、1 mmol／L丙酮酸鈉、10 mmol／L Hepes、50 000 IU慶大霉素、2%的同基因SD大鼠血清、8%FBS和50 U／ml rhIL-2）調細胞密度至1× 106／ml，置37℃、5%CO2培養箱中培養。5～7 d后，用增殖培養基調T細胞濃度至1×106／ml，與1 ×107／ml同基因SD大鼠絲裂霉素C（50 μg／ml，37℃孵育30 min）處理的脾細胞懸液（作為抗原遞呈細胞）及MBP（25 mg／L）在37℃、5%CO2培養箱中共同培養。2～3 d后，用Ficoll淋巴細胞分離液分離活化的T細胞，再以增殖培養基培養擴增5～7 d。在T細胞生長培養基中，當T細胞開始變小，并不再增殖時，則用MBP再次刺激T細胞活化、培養擴增。如此反復，經過3個活化、擴增循環后，便可得到足夠數量的MBP-T細胞。

1.4 淋巴細胞增殖分析將MBP-T細胞用不含rhIL-2的增殖培養基調整為2×106／ml濃度，按實驗設計分組，每組設3個復孔，分別取100 μl加入到96孔培養板中，細胞密度為2×105個細胞／孔，同時在每孔中均加入2×106個絲裂霉素C處理的脾細胞作為抗原遞呈細胞。然后在每孔中加入25 μg／ml MBP（MBP刺激組）或25 μg／ml BSA（BSA對照組），以及只加培養基（陰性對照組）。最后，各組添加不含rhIL-2增殖培養基至終體積為200 μl，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育48 h，加入3.7× 10－5GBq／well的3H-TdR，再進一步培養18 h，用多頭收集儀將細胞收集到玻璃纖維膜上，并用β液體閃爍計數儀測定細胞摻入的放射性強度。

1.5 流式細胞術細胞表面標志染色：將待測細胞用冰冷PBS洗滌后，用染色緩沖液（含5%FBS、0.1%NaN3的PBS）配制成2×106／ml的細胞懸液。在離心管中預先加入熒光素標記抗體：CD3-FITC（1 μg／106細胞）、CD4-PE（0.25 μg／106細胞）和CD8-APC（0.2 μg／106細胞）；同時設立不加抗體的空白對照管。每管加細胞懸液50 μl置室溫20 min，然后用PBS離心洗滌2次，最后加含1%PFA的PBS 0.4 ml固定。胞內細胞因子染色：將1×106MBP-T細胞培養于不含rhIL-2的增殖培養基中，分別添加25 μg／ml MBP（MBP刺激組）、25 μg／ml BSA（BSA對照組），同時設立只加培養基的陰性對照組。于37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h，加入monesion至終濃度2 μmol／L，用于阻滯細胞因子蛋白分泌，繼續培養4 h后收集細胞用于檢測。用PBS洗滌細胞后，加2%PFA 400 μl，4℃避光30 min以上以固定細胞。然后，用染色緩沖液（1 ml／管）4℃1 000 r／min離心5 min洗細胞1次，加400 μl透膜緩沖液（含0.1%Saponin-5%FBS的PBS）4℃避光透膜15 min，離心棄上清液，同時加入細胞因子抗體：IFN-γ-FITC（1 μg／106細胞）、IL-10-PE（1 μg／106細胞）和IL-4-eFluor?660（1 μg／106細胞），4℃避免孵育30 min。每管加透膜緩沖液1 ml，4℃、1 000 r／min離心5 min，洗2次，加1%PFA 400 μl固定。用FACS Calibur流式細胞儀Cellquest軟件檢測待檢樣品，所得數據文件用Cellquest或WinMDI 2.9軟件分析。

1.6 統計學處理兩組數據之間的比較采用t檢驗，3組數據之間的比較采用方差分析和q檢驗，數據以±s表示，應用Excel進行統計分析。

2 結果

2.1 MBP-T細胞的表型特征 MBP免疫9 d后，在新鮮分離的淋巴結細胞（lymph node cells，LNC）中，CD3＋細胞占細胞總數的百分比為（59.98± 7.16）%，在CD3＋細胞中CD3＋CD4＋的細胞為（74.78±8.77）%，CD3＋CD8＋的細胞為（20.21± 2.78）%。經過體外3個循環的刺激、擴增后，MBP活化擴增的細胞主要為CD3＋的T淋巴細胞（98.62 ±0.71）%，在CD3＋細胞中CD3＋CD4＋的細胞占絕大多數，為（97.29±1.44）%，而CD3＋CD8＋的細胞則非常少，其比例僅為（1.70±1.23）%。MBP活化擴增的細胞與新鮮分離的LNC比較，其CD3＋細胞占細胞總數的比例和CD3＋細胞中CD4＋細胞的比例均明顯升高，而其CD8＋細胞的比例則明顯降低，各指標比較差異有統計學意義（P＜0.01，t＝12.01、5.66、13.62）。見圖1。

2.2 MBP抗原特異性淋巴細胞增殖分析在陰性對照組和BSA對照組，所有的細胞均沒有明顯的增殖反應，其3H-TdR摻入量分別為（655.40±171.86）cpm和（677.20±220.97）cpm，兩者之間差異無統計學意義。當存在25 μg／ml MBP的情況下，MBP-T細胞的3H-TdR摻入量明顯增高，達（14 094.80± 3 300.75）cpm，與陰性對照組和BSA對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01，F＝82.16）。

2.3 MBP-T細胞分泌細胞因子的特征流式細胞術胞內細胞因子檢測表明：在陰性對照組和BSA對照組，MBP-T細胞中均幾乎檢測不到IFN-γ、IL-10和IL-4的表達。在陰性對照組中，三者表達的陽性細胞僅分別為（1.13±0.63）%、（0.76±0.24）%和（0.59±0.16）%；在BSA對照組中，三者表達的陽性細胞也僅分別為（1.30±0.55）%、（0.95± 0.47）%和（0.64±0.19）%。3種因子的表達率在兩組之間差異均無統計學意義。用MBP刺激后，IFN-γ和IL-10表達的陽性細胞則明顯增加，分別為（28.08±6.85）%和（14.67±5.52）%，與陰性對照組和BSA對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。但是，仍幾乎檢測不到IL-4的表達，其比例僅為（0.69±0.36）%，與陰性對照組和BSA對照組比較差異無統計學意義（F＝75.86、31.02、0.159）。見圖2。

3 討論

CNS損傷后，由于損傷部位組織細胞的壞死和凋亡，CNS抗原能夠釋放出來，激活免疫系統產生一系列免疫反應，包括損傷局部小膠質細胞的活化，外周單核巨噬細胞、淋巴細胞等的浸潤。隨后，CNS抗原可以被活化的小膠質細胞或單核巨噬細胞加工遞呈給相應的T淋巴細胞，使之活化，從而產生針對自身CNS抗原反應的T細胞群體［7］。雖然目前對自身反應性T細胞對在CNS損害后的作用仍存在爭議，但是其參與CNS損傷與修復的過程是毋容置疑的［8］。在這些CNS自身反應性T細胞中，MBP活化的T細胞倍受研究者關注，因此對于該細胞在CNS損傷修復中的爭議也很多［9－11］。

在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究［12］中，通過MBP免疫EAE敏感的動物（如Lewis大鼠）是建立EAE模型的經典方法。采用MBP主動免疫這些動物品系能夠誘導典型的EAE表現，也可以通過體外擴增的方法獲得MBP特異的T細胞。但是，這些細胞在隨后的過繼免疫治療研究［10］中常常會出現中樞神經損害性的結果。為了盡量減少過繼免疫誘發的EAE癥狀對評價自身免疫保護效應的干擾，本研究在前期的實驗中采用SD大鼠［9］。與EAE-敏感的Lewis rat大鼠不同，SD大鼠是EAE-抵抗種系，結果表明MBP-T細胞過繼免疫同種系的SD大鼠可以激發中樞神經保護作用［9］。本研究采用流式細胞術鑒定這類細胞的表型和細胞因子分泌特征，以期為目前存在的爭議提供可能的解釋。

研究顯示，在新鮮分離的LNC中，CD3＋細胞占細胞總數約60%，其中CD3＋CD4＋的細胞約為75%，而CD3＋CD8＋的細胞約為20%。經過體外3個循環的刺激、擴增后，MBP活化擴增的細胞主要為CD3＋的T淋巴細胞，且CD3＋CD4＋的細胞占絕大多數（98%），與文獻［9，13］報道一致。3H-TdR摻入實驗表明這種細胞是MBP特異性的。根據分泌細胞因子種類的不同，分化的CD4＋Th細胞可分為Th1、Th2、Th3和Tr1等細胞亞群。Th1細胞主要分泌IL-2和IFN-γ，主要介導細胞免疫應答；Th2主要分泌IL-4和IL-5，主要介導體液免疫；Tr1／Th3主要分泌IL-10／TGF-β，對免疫系統的功能具有抑制性調節作用［14－15］。本研究顯示MBP-T細胞表達IFN-γ和IL-10，卻沒有檢測到IL-4，這說明在MBP-T細胞中除了Th1細胞存在外，還有一定比例的具有免疫抑制調節作用的Tr1細胞亞型，這類細胞在CNS免疫反應過程中可能具有特有的調節功能（如調節損傷局部巨噬細胞或小膠質細胞的活化），從而影響CNS損傷的最終結局。

綜上所述，用MBP免疫SD大鼠，經過體外擴增可以獲得MBP特異性的T細胞，其表型主要為CD3＋CD4＋，并可以按照細胞因子的產生區分為Th1和Tr1亞型。

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Culture and identification of myelin basic protein activated T cells in SD rats

Zhao Hao1，2，Yu Liang2，Zhang Jingxing3，et al

（1Dept of Medical Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；
2Central Laboratory，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004；
3Anhui Provincial Key Laboratory of Tissue Transplantation，Bengbu 233030）

ObjectiveTo culture the myelin basic protein（MBP）specific T lymphocytes in SD rats，and identify their characterization of phenotype and cytokine profiles.MethodsThe SD rats were immunized with MBP；the draining lymph nodes were collected and made into single cell suspension.The cells were cultured in RMPI 1640 medium and stimulated repeatedly with MBP to produce MBP specific T（MBP-T）cells.Then，their reactivity to MBP stimulation was measured using3H-thymidine（3H-TdR）incorporation，the phenotype and cytokine profiles were determined using flow cytometry.ResultsWhen the MBP antigen exists，3H-TdR incorporation of MBP-T cells increased obviously.Flow cytometry showed that MBP-T cells were mainly CD3＋CD4＋T lymphocytes（98%），and could produce interferon-γ（IFN-γ）and interleukin-10（IL-10）.Conclusion The cells collected from the draining lymph nodes of MBP immunized SD rats could be amplified into MBP-T cells in vitro.The phenotypes of these cells are mainly CD3＋CD4＋，and show the Th1 and Tr1 cytokine profiles.

myelin basic protein；lymphocytes；immunity；flow cytometry

R 392.12

A

1000－1492（2015）

2014－09－23接收

國家自然科學基金（編號：81071268、81271363）

1安徽醫科大學附屬省立醫院檢驗科，合肥 230001

2蚌埠醫學院第一附屬醫院中心實驗室，蚌埠 2330043組織移植安徽省重點實驗室，蚌埠 233030

趙 皓，男，主管檢驗師，碩士研究生；

王保龍，男，教授，主任檢驗師，博士生導師，責任作者，E-mail：wbl196555＠163.com