骨髓源性EPCs對脊髓源性NSCs增殖分化的影響

張 碩，杜怡斌，杜公文，張 輝，余 濤，方家劉，高維陸，尹宗生

骨髓源性EPCs對脊髓源性NSCs增殖分化的影響

張 碩1，杜怡斌2，杜公文2，張 輝2，余 濤2，方家劉2，高維陸2，尹宗生

目的觀察骨髓源性內皮祖細胞（EPCs）對脊髓源性神經干細胞（NSCs）增殖分化的影響。方法通過密度梯度離心法獲取骨髓血單個核細胞，以EBM-2進行誘導培養EPCs并進行免疫細胞化學染色鑒定，成熟的方法獲取及鑒定SD大鼠的脊髓NSCs，1×105／ml第3代NSCs置于Transwell小室下層與1×105／ml上層原代EPCs進行體外1∶1共培養，以單純第3代的NSCs培養為對照，培養7 d，雙盲法分別計數各組在相差顯微鏡下神經球形成的數目，并用目鏡測微尺測量神經球的平均直徑，通過5%血清誘導培養NSCs 7 d后，行β-微管蛋白－Ⅲ免疫熒光染色，Hoechst細胞核染色后在顯微鏡下計算神經元／細胞總數得出百分率。結果骨髓源性EPCs與脊髓源性NSCs共培養組神經球平均數目為（22.27±3.85）個，平均直徑為（61.70±7.21）μm，誘導培養后分化為神經元的平均百分率為（46.10±3.70）%，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論 骨髓源性EPCs能促進脊髓源性NSCs增殖及其向神經元分化。

NSCs；EPCs；增殖；分化；微環境；脊髓損傷

神經干細胞（neural stem cells，NSCs）移植一直是脊髓損傷的主導研究手段，通過促進移植到損傷脊髓中的NSCs有效分化為神經元，促進神經生發，從而達到重建神經通路，促進脊髓神經修復的作用。但大量實驗研究［1］顯示移植到脊髓中的NSCs最終絕大部分分化成為星形膠質細胞形成瘢痕，神經生發的比例很低。脊髓本身存在一定數量的NSCs（內源性NSCs），NSCs或其他類型干細胞甚至神經組織的移植，其作用都是改善了脊髓損傷后局部的微環境，通過對脊髓NSCs的誘導作用，從而促進神經功能修復［2］。研究［3］表明影響NSCs增殖分化的外在因素包括細胞因子和微環境，是多種細胞因子相互促進影響的結果，脊髓損傷后出血、水腫、缺氧及炎癥造成內環境的破壞不利于NSCs神經生發，有效改善脊髓微環境是研究修復脊髓損傷的關鍵。NSCs所處的微環境中，血管內皮細胞起著重要的營養支持作用，神經生發往往出現于血管生發之后，血管生發為神經生發提供了良好的平臺，兩者相輔相成，所共處的環境被稱為神經血管微環境［4］。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要來源于骨髓內，并以不同分化階段存在于外周血，研究［5］表明EPCs及血管內皮細胞能分泌多種細胞因子促進神經的生發，其中主要有血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGF）等。該研究采用EPCs與NSCs共培養的方法，觀察EPCs對NSCs增殖及向神經元分化的影響，為EPCs移植修復受損神經和治療脊髓損傷提供相關的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料骨髓源性EPCs的供體實驗動物：SD大鼠，雄性，90～120 g，SPF級；脊髓源性NSCs的供體實驗動物：新生SD大鼠，SPF級，5～7 d；均由安徽省實驗動物中心提供。EBM-2培養基（CC-3156）由EBM-2與EGM-2 SingleQuots組成，后者含血清10 ml、氫化可的松0.2 ml、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，FGF）2 ml、VEGF 0.5 ml、IGF 0.5 ml、抗壞血酸0.5 ml、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）0.5 ml、GA-1000 0.5 ml、肝素0.5 ml，購自美國Clonetics公司；大鼠骨髓淋巴細胞分離液試劑盒，購自天津TBM公司；鼠纖維聯接蛋白（rat fibronectin，FN）購自美國Gene Operation公司；Dil-Ac-LDL購自美國Invitrogen公司；CD133抗體購自美國Biorbyt公司；DMEM／F12（1∶1）培養基、B27、左旋谷氨酸均購自美國Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國Peprotech公司；Flk-1抗體、FITC-UEA-1、大鼠Nestin抗體、β-Tubulin（3H3091）抗體均購自美國Santa Cruz公司；24孔板Transwell（孔徑0.3 μm）購自美國Corning公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓源性EPCs分離培養 參考文獻［6－7］方法，SD大鼠（90～120 g）頸椎脫臼法處死，消毒后無菌條件下取出雙下肢股骨及脛骨，剪去兩端干骺端，暴露骨髓腔，一次性注射器抽取F液沖洗收集骨髓血，1 800 r／min離心20 min，棄上清液，沉淀用全血組織稀釋液懸起，取等體積C液5 ml加入15 ml離心管，再緩慢將細胞懸液加于C液之上，兩個體積比為1∶1，注意保持兩者之間的界面清晰，勿使其彼此混合，水平離心機離心，1 500 r／min離心25 min，離心管從上到下依次為稀釋液層，薄薄云霧狀單個核細胞層，透明分離液層，紅細胞層。以毛細管吸出單個核細胞層，以細胞洗滌液離心洗滌細胞2次，棄上清液，細胞沉淀以EBM-2完全培養基重懸，并計數，調整細胞濃度，以5×105／ml細胞濃度接種到預先用FN（10 μg／ml）包被過的24孔板中，每孔1 ml，輕輕晃動培養板使細胞分散均勻，37℃、5% CO2的恒溫培養箱培養。2 d后首次換液去除為貼壁細胞，以后隔3 d換液，約9 d左右，細胞融合度達到約90%，即可傳代。

1.2.2 骨髓源性EPCs鑒定 參考文獻［6－7］方法，EPCs免疫熒光化學染色：取培養8 d的EPCs，孔內培養液吸棄，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗，0.5%Triton X-100破膜10 min，PBS沖洗后10%山羊血清封閉置于CO2培養箱孵育1 h，吸棄多余血清，滴加小鼠抗CD133（1∶100）及兔抗VEGFR-2（1∶100）一抗，室溫過夜，PBS沖洗，加入對應二抗（1∶100），避光孵育1 h，PBS沖洗，添加10 μg／ml Hoechst33342核染色5 min，PBS沖洗，抗熒光淬滅液封片，倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。Dil-Ac-LDL與FITC-UEA-1檢測：取培養8 d的EPCs，吸棄孔內液體，PBS沖洗后，每孔加入400 μl Dil-Ac-LDL（10 mg／L），CO2培養箱避光4 h后取出，PBS沖洗后4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗；每孔加入400 μl FITC-UEA-1（10 mg／L），孵育1 h，PBS沖洗，抗熒光淬滅液封片，倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.2.3 脊髓源性NSCs分離、培養及鑒定 參考文獻［8］方法，5～7 d新生SD大鼠，頸椎脫臼法處死，消毒后在超凈臺內剪開背部皮膚，無菌條件下取出胸腰段脊髓，剪碎至0.5 mm3大小，反復吹打后200目細胞篩濾去組織雜質，收集懸液離心，1 000 r／min離心5 min，沉淀用NSCs培養基（含10 ng／ml bFGF、20 ng／ml EGF、2%B27和0.6 mg／ml谷氨酰胺的DMEM／F12液）重懸，接種于培養瓶，37℃、5% CO2培養箱培養，2～3 d半量換液，約7～9 d以機械吹打法傳代。取狀態良好的第3代細胞球行Nestin鑒定。

1.2.4 骨髓源性EPCs對脊髓源性NSCs增殖及分化的影響 參考文獻［9］方法，對照組：收集純化后培養的第3代NSCs細胞球吸管緩慢吹打成單細胞懸液，去除原培養液，以1×105／ml接種于含有涂有多聚賴氨酸的無菌蓋玻片24孔培養板，更換培養液為DMEM／F12＋無血清EBM-2（1∶1），37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，每3 d半量換液，培養7 d，觀察NSCs生長情況。EPCs和NSCs共培養組：同對照組的基礎上在孔內放置24孔板Transwell，取載有貼壁原代生長良好EPCs（細胞融合度達到約90%）蓋玻片，EPCs置于Transwell膜上，NSCs位于Transwell膜下。記細胞數為1×105／ml，兩者比例為1∶1，37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，每日觀察細胞形態變化，培養7 d，100個隨機視野下雙盲法分別計數各組在相差顯微鏡下克隆球形成的數目，并隨機選取20個視野并用目鏡測微尺測量每個視野所有神經球的平均直徑（每個神經球的直徑＝橫徑／2＋垂直徑／2），取均值，進行統計學分析。觀察后，兩組均用5%血清誘導培養NSCs 7 d，行β-微管蛋白-Ⅲ免疫熒光染色，Hoechst核染色，隨機取20個視野，在顯微鏡下計算神經元／細胞總數得出百分率，并進行統計學分析。

1.3 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析，數據以±s表示。兩組間比較使用t檢驗。

2 結果

2.1 EPCs分離、培養及鑒定結果新分離出的骨髓單個核細胞呈圓形，體積較小，見圖1A；48 h待細胞貼壁緊密后首次換液，移除懸浮細胞，首次換液后細胞生長加快，可見紡錘形、三角形、圓形等不同形態的細胞，見圖1B；第7天可見EPCs的形態特征，以梭形細胞為主，見圖1C；第9～10天，細胞迅速增殖，融合度達到80%～90%，可見細胞集落及線狀結構形成，見圖1D；第12～14天，大部分細胞呈多角形，微血管樣生長，見圖1E、F。EPCs免疫熒光化學染色結果：骨髓源性單個核細胞體外培養8 d時，行免疫熒光化學檢測細胞表面抗原CD133及VEGFR-2表達情況，Hoechst核染色，見圖2A；CD133染色的細胞表面呈紅色熒光，見圖2B；VEGFR-2染色的細胞呈綠色，見圖2C；大部分細胞呈雙陽性，表明該細胞為EPCs。Dil-Ac-LDL與FITCUEA-1檢測：倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，Dil-Ac-LDL細胞攝取呈紅色，見圖2D；FITC-UEA-1呈綠色，見圖2E。

2.2 NSCs分離、培養及鑒定結果新鮮分離的單個NSCs呈圓形，懸浮狀，折光性較好，分散存在，2 d后細胞逐漸聚集生長形成5～7個細胞的細胞團，培養7 d，增大至典型的球形（神經球），由數百個細胞構成，懸浮生長于培養基中，見圖3A；原代培養7～9 d受周圍雜細胞及死亡細胞釋放毒性物質的影響，細胞球中央細胞折光性逐漸減弱、周邊邊境清晰，細胞生長速度較慢，此時機械吹打分離，進行細胞傳代，傳代后細胞增殖加快，形成的神經球形狀規則，呈球形懸浮生長，收集生長狀態良好的第3代神經球，Hoechst標記細胞核，見圖3B，行抗Nestin抗體染色，見圖3C。

2.3 兩組NSCs增殖及分化結果倒置顯微鏡下觀察兩組NSCs神經球數及球直徑的變化，NSCs接種后呈單細胞懸浮生長，2 d后，兩組NSCs逐漸聚集形成神經球，但神經球數量及直徑無明顯區別，4～5 d后，共培養組神經球數比對照組明顯多，而且球直徑明顯增大，于培養7 d后100倍視野下觀察，共培養組神經球數比對照組繼續增多，球直徑繼續增大，每組100個隨機視野下雙盲法分別計數各組在相差顯微鏡下神經球形成的數目，共培養組為（22.27±3.85）個，對照組為（13.77±2.97）個，兩組比較差異有統計學意義（t＝17.463，P＜0.01）；并隨機選取20個視野并用目鏡測微尺測量每個視野所有神經球的平均直徑，共培養組為（61.70± 7.21）μm，對照組為（41.60±4.10）μm，兩組比較差異有統計學意義（t＝10.846，P＜0.01）。兩組觀察后5%血清誘導培養NSCs 7 d后，Hoechst核染色，行β-微管蛋白-Ⅲ免疫熒光染色，隨機取個20視野，在顯微鏡下計算神經元／細胞總數得出百分率，共培養組為（46.10±3.70）%，對照組為（16.95± 3.66）%，兩組比較差異有統計學意義（t＝25.046，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

脊髓損傷后引起一次機械性組織損傷和二次化學性變性，其中二次變性中關鍵的是血管的丟失，血流減少引起組織的缺氧、水腫及炎癥細胞的滲透，造成內環境的嚴重破壞，微環境的破壞不利于脊髓內源性神經生發和軸突再生［3，10］。調節NSCs分化的分子機制尚不太清楚，目前研究［11－13］表明，除了NSCs固有性狀外，其外在的微環境包括生長因子、細胞因子及細胞間接觸等在NSCs增殖分化過程中都扮演了重要角色。NSCs所處的微環境主要由5種細胞構成：NSCs、傳遞放大細胞、神經母細胞、室管膜細胞和血管內皮細胞，室管膜細胞被認為是一種潛在的內源性NSCs，血管內皮細胞則起著重要的營養支持作用［4］。

EPCs能夠分泌多種細胞因子如BNDF、VEGF、IGF等均被證明能夠促進神經生發［11－13］。EPCs是一種異質性的細胞群體，主要來源于骨髓復雜的前體細胞，并以不同的分化階段存在于外周循環中，骨髓中EPCs的含量遠超過外周血，骨髓源性的EPCs能以血管發生的方式參與出生后的生理與病理性的血管形成，作為內皮細胞的前體細胞，能夠選擇性地歸巢受損或者缺血部位，參與局部的血管發生，從而形成血管，促進內皮的修復。

脊髓損傷后骨髓源性EPCs的移植能夠促進局部新生血管的形成以及反應性星形膠質細胞聚集，減少炎癥細胞滲透［10］。在體外分離獲得脊髓損傷后出現的反應性星形膠質細胞，發現其具備NSCs的特點，并能夠分化為神經元，脊髓損傷后反應性星形膠質細胞大量增加［14］，能夠廣泛表達VEGF受體-3［15］，而VEGF又有明確的促神經生發作用［12］，EPCs主要表達的細胞因子就是VEGF，這就充分利用反應性星形膠質細胞的NSCs特性將解決內源性NSCs的數量問題。

由于骨髓源性EPCs與脊髓源性NSCs兩種細胞的增殖周期及生長特性不同，本實驗采用Transwell經典共培養系統，兩者比例為1∶1，接種細胞濃度為1×105／ml，并設立對照組。7 d后，高倍鏡下共培養組神經球數量比對照組明顯多，而且直徑更大；EPCs共培養NSCs分化的結果提示：共培養組β-tubulin-Ⅲ陽性率為46.10%，對照組β-tubulin-Ⅲ陽性率為16.95%。與對照NSCs組相比，共培養組EPCs明顯促進NSCs的增殖及其向神經元分化。這可能與EPCs作為內皮細胞的前體細胞能夠分泌VEGF、BDNF、IGF、PEDF型膠原等多種細胞生長因子，通過Transwell小室中細胞不能通過聚碳酸脂膜作用于NSCs，這種調控相對于加細胞因子更具有安全性和持久性，為NSCs提供合適的微環境，促進NSCs的增殖及其向神經元分化。但兩者之間主要作用機制有待進一步驗證。

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The effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells on the proliferation and differentiation of spinal cord-derived neural stem cells

Zhang Shuo1，Du Yibin2，Du Gongwen2，et al
（1Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）on the proliferation and differentiation of spinal cord-derived neural stem cells（NSCs）.MethodsBone marrow mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation methods and EPCs were cultured by EBM-2 basal medium，identified by fluorescent immunocytochemistry.Spinal cord-derived NSCs were isolated，cultured and identified by the mature methods.1×105／ml tertiary NSCs were plated on the base of culture wells，the upper transwell compartment was seeded with 1×105／ml primary EPCs，EPCs and NSCs（1∶1）were co-cultured in vitro，set the untreated tertiary NSCs as a control group.7 days after co-culture，the number and diameter of neurospheres were calculated and measured with the double blind method.After that，NSCs were maintained for 7 days in DMEM／F12＋5%serum medium，and immunochemically stained with neuronal specific marker β-tubulin-Ⅲ，ratio of positive cells to total cells was calculated.ResultsThe average number of neurospheres in co-culture group was（22.27±3.85）and the average diameter was（61.70±7.21）μm.The percentage of neurons immunostaining was（46.10±3.70）%，differences are statistical significance compared with the control group（P＜0.01）.ConclusionBone marrow-derived EPCs promote the proliferation of spinal cord-derived NSCs and induce the differentiation of spinal cord-derived neural stem cells into neurons.

neural stem cells；endothelial progenitor cells；proliferation；differentiation；niche；spinal cord injury

R 681.54

1000－1492（2015）01－0020－05

2014－09－25接收

國家自然科學基金（編號：81171173）；安徽省自然科學基金（編號：11040606Q25）

1安徽醫科大學第四附屬醫院骨科，合肥 2300222安徽醫科大學第一附屬醫院骨科，合肥 230022

張 碩，男，碩士研究生；尹宗生，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：yinzongsheng1961＠sina.com