一個先天缺牙家系的基因突變及病例對照研究

王 璟，陳 靜，沈 韻，吳松濤，黃稔歡，王飛宇，賴文莉

一個先天缺牙家系的基因突變及病例對照研究

王 璟1，2，陳 靜2，3，沈 韻1，吳松濤2，黃稔歡2，王飛宇2，賴文莉

目的探討非綜合征型多數牙先天缺失患者的人類成對盒基因9（PAX9）、同源盒基因1（MSX1）、中軸抑制蛋白2（AXIN2）突變位點，為該疾病的病因學研究提供依據。方法對該例患者及其家庭成員進行全身系統檢查、口腔專科檢查（含拍攝曲面斷層片）及家系調查；抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增PAX9基因的外顯子1、2、3、4，MSX1基因外顯子1、2及AXIN2基因外顯子2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，通過對分段PCR純化產物進行測序，并結合系譜圖進行基因突變分析。同時，通過病例－對照實驗（先天缺牙組50例，健康對照組100例）對突變位點AXIN2G1807C與先天缺牙的相關性進行分析。結果先證者的祖母和外祖父為兄妹關系。口內檢查以及曲面斷層片發現先證者為無牙牙合，僅見左側下頜升支處有一阻生牙影像，其余家庭成員牙齒數目發育正常。均未合并其他組織器官的先天發育異常。先證者及部分表型正常者分別發現3個已知突變位點，分別為AXIN2外顯子6第1 365位A變為G（rs9915936），外顯子7第1 807位G變為C（rs145353986）以及外顯子8第2 062位C變為T（p. Leu688Leu）。PAX9、MSX1未見異常。病例組和對照組間AXIN2G1807C的基因頻率和基因型頻率差異無統計學意義。結論AXIN2c.2062C＞T突變可能是導致中國人群非綜合征型多數牙缺失的危險因素之一。AXIN2c.1807G＞C與此類疾病之間不存在明顯的相關性。

非綜合征型先天缺牙；成對盒基因9；肌節同源盒基因1；中軸抑制蛋白2

先天缺牙是臨床常見的發育異常性疾病之一，目前病因尚不明確。多數研究［1－4］認為先天缺牙是由遺傳和環境等多因素共同作用所致，其中遺傳因素起主導作用。現階段先天性缺牙的遺傳學研究大多集中于對候選基因的突變篩選，成對盒基因（paired box 9，PAX9）、肌節同源盒基因（muscle segment homeoboxgene1，MSX1）、中軸抑制蛋白（axis inhibition protein 2，AXIN2）是目前較為公認的與先天缺牙有關的候選基因［5］。基因型－表型遺傳分析認為，MSX1基因突變造成了大多數前磨牙和第三磨牙的先天缺失，而PAX9基因突變主要影響磨牙的發育［5－7］。為了探討中國先天缺牙患者表型與基因型的關系，現對一個特殊的先天缺牙家系進行了臨床及MSX1、PAX9和AXIN2基因突變分析，并通過病例－對照實驗進一步驗證已發現的相關位點。

1 材料與方法

1.1 病例資料及背景調查該研究由四川大學華西口腔醫院倫理委員會批準（2009022）。所有志愿者均為漢族人，來自中國成都及其周邊地區，充分了解本研究內容并簽署知情同意書。先證者及其家庭成員調查：先證者（Ⅳ-2）因全口牙齒缺失于四川大學華西口腔醫院就診。通過多次家訪求證，收集先證者及其家系成員的詳細資料并繪制系譜圖。對先證者及其家庭成員進行詳細全身系統檢查、口腔專科檢查并記錄相關病史，包括頭發、指甲、皮膚、汗腺等外胚葉來源組織的檢查以及口腔曲面斷層片檢查。病例－對照試驗：征集2009年10月～2011年11月于四川大學華西口腔醫院就診患者及健康志愿者，共納入單純性牙缺失患者50例和健康志愿者100例，對其進行全面的口腔專科檢查，包括拍攝口腔曲面斷層片。同時，對其進行詳細的全身系統檢查，包括頭發、指甲、皮膚、汗腺等外胚葉來源組織的檢查，并記錄相關病史。

1.2 基因篩查

1.2.1 樣本采集及DNA提取 分別抽取志愿者外周靜脈血各5 ml，加入1 ml ACD（1.32%檸檬酸鈉，0.48%檸檬酸，1.47%葡萄糖）抗凝，采用酚－氯仿抽提法提取基因組DNA。

1.2.2 引物設計與合成 根據MSX1、PAX9和AXIN2在NCBI GenBank中的全序列設計引物，分別擴增PAX9基因第1～4外顯子［8］、MSX1基因第1、2外顯子［8］以及AXIN2基因第2～11外顯子［8］，引物均由上海生工生物工程有限公司采用Oligo Primer Analysis Software合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增目的片段 反應總體積為50 μl，其中加入10×反應緩沖液（MgCl2濃度為2 mmol／L）5 μl、基因組DNA約3 μl、TaqDNA聚合酶（TaKaRa Biotechnology，Dallian China）2.5 U，使dNTP終濃度達到0.3 μmol／L，上下游引物的終濃度均達到0.3 mol／μl。循環參數設置為：94℃變性5 min，94℃0.5 min，56℃0.5 min，72℃1 min，35個循環，72℃延伸7 min，4℃保存。全部PCR產物均經過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認。

1.2.4 PCR產物純化及DNA測序 電泳分離PCR產物，切取DNA條帶，使條帶的相對分子量為預期大小，采用膠回收試劑盒回收該條帶，除去PCR引物、酶及其他雜質，得到純化的PCR產物。利用BigDye四色熒光測序反應試劑盒（BigDye Terminator Kit），以所得的純化PCR產物為模板在9600型PCR儀上進行測序反應，反應參數為：98℃變性120 s，96℃10 s，50℃5 s，60℃120 s，25個循環。反應結束后，采用ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀進行序列測定，其測序結果采用DNAstar軟件進行編輯、比較。

1.2.5 突變分析和蛋白預測 在NCBI GenBank上將所得的測序結果與人類基因組PAX9、MSX1、AXIN2基因序列進行同源序列比較，并參照系譜圖進行基因突變分析（GenBank accession：PAX9，NC_ 000014.837126773－37147012；MSX1，NG_008121. 1；AXIN2，NG_012142.1）。三維蛋白結構預測模型預測AXIN2G1807C所引起的蛋白構象的改變。

1.3 統計學處理采用χ2檢驗分析AXIN2G1807C突變位點基因頻率和基因型在病例組和對照組之間的差異（SPSS 17.0，IBM，New York，NY，USA）。

2 結果

2.1 臨床診斷結果先證者家族中無先天缺牙病史及結腸癌史，其祖母及外祖父為兄妹關系，見圖1 A。口內檢查及曲面斷層片結果顯示：先證者（Ⅳ－2）為無牙牙合，僅見左側下頜升支處有一阻生牙，患者口內及X-RAY影像見圖1B、1C。追問病史，患兒家長述乳牙期存在相同部位牙缺失，既往無外傷及疾病史，有近親婚配史，無遺傳史。其余家庭成員牙齒數目發育正常，無類似病史。均未合并口面裂、皮膚及其附屬組織、毛發等其他組織器官的先天發育異常。

2.2 基因篩查及蛋白預測結果先證者（Ⅳ-2）及部分表型正常者分別發現3個已知突變位點，分別為AXIN2外顯子6第1 365位A變為G（rs9915936），見圖2。外顯子7第1 807位G變為C（rs145353986），見圖3、4。外顯子8第2 062位C變為T（p.Leu688Leu），見圖5。PAX9、MSX1未見異常。通過蛋白結構預測發現，外顯子7第1 807位G變為C（rs145353986）后所對應的蛋白結構相較于正常蛋白結構存在差異，見圖6。

2.3 AXIN2G1807C與先天缺牙的相關性分析AXIN2G1807C基因頻率在兩組之間差異無統計學意義（χ2＝0.107，P＝0.743）。同時，AXIN2G1807C基因型頻率在兩組之間差異無統計學意義（χ2＝0.571，P＝0.804）。

3 討論

在AXIN2測序結果中，本研究檢測到先證者（Ⅳ-2）存在3個已知突變，分別為外顯子6第1 365位A變為G（rs9915936），外顯子7第1 807位G變為C（rs145353986），外顯子8第2 062位C變為T（p.Leu688Leu）。

作為Wnt信號轉導通路的負反饋調節因子，AXIN2調控胚胎的發育和組織的形成。前期有關牙發育的分子研究［9］證實在牙發育過程中有大量的Wnt基因的表達，其表達的變化與否影響牙的發育。AXIN2c.1365A＞G（rs9915936）分布于正常人群中，與多數牙缺失的相關性不大。Mostowska et al［10］研究發現AXIN2c.2062C＞T突變增加了牙缺失的風險，與本研究結果一致，由此可以推測AXIN2c.2062C＞T突變可能是導致先證者（Ⅳ-2）多數牙缺失的危險因素之一。AXIN2基因外顯子7上的雜合突變，即第1 807位核苷酸由G變為C，屬于錯義突變類型，相應的第603位氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸。堿基的替代發生在編碼區，有可能引起相應蛋白的變化，從而引起牙發育的異常。通過蛋白結構預測發現，堿基異常改變后所對應的蛋白結構相較于正常蛋白結構存在差異。AXIN2基因外顯子7是目前該基因突變的研究熱點之一［1］，但有關AXIN2G1807C突變位點的報道較少。在本研究中，表型正常者Ⅲ-2也檢出這一基因突變。因此，先證者（Ⅳ-2）多數牙先天缺失是否與AXIN2基因的這一突變位點有關，還是與其他基因共同起作用有關，有待于深入研究。本研究通過進一步的病例－對照研究證實該突變位點與非綜合征型多數牙先天缺失之間不存在明顯的相關關系，為研究AXIN2基因突變與此類疾病之間的關系提供了一個新的依據。

目前，非綜合征型先天缺牙的病因和發病機制尚不清楚，大多數學者認為該疾病是遺傳和環境共同作用的一種多因素疾病，具有其復雜性［11］。迄今為止，對于引起同一基因型而表型不同的原因尚不明確，基因型和表型之間是否確實存在劑量關系仍然存在爭議。本研究結果顯示AXIN2c.2062C＞T突變可能是導致先證者（Ⅳ-2）多數牙缺失的危險因素之一，證實AXIN2c.1807G＞C與非綜合征型多數牙先天缺失之間不存在明顯的相關關系。由于多個基因突變可引起先天缺牙，每個基因具有多種突變形式，且存在遺傳異質性，采用候選基因篩選突變所得的陽性率并不高，因而需要收集更多的先天性缺牙家系對該病的病因學進行探索以及提供足夠的樣本量和參照已建立的數據庫進行相關性分析。

［1］ Zeng L，Fagotto F，Zhang T，et al.The mouse Fused locus en-codes Axin，an inhibitor of the Wnt signaling pathway that regulates embryonic axis formation［J］.Cell，1997，90（1）：181－92.

［2］ Callahan N，Modesto A，Meira R，et al.Axis inhibition protein2（AXIN2）polymorphisms and tooth agenesis［J］.Arch Oral Biol，2009，54（1）：45－9.

［3］ Burzynski N J，Escobar V H.Classification and genetics of numeric anomalies of dentition［J］.Birth Defects Orig Artic Ser，1983，19（1）：95－106.

［4］ Graber L W.Congenital absence of teeth：a review with emphasis on inheritance patterns［J］.J Am Dent Assoc，1978，96（2）：266－75.

［5］ Nieminen P.Genetic basis of tooth agenesis［J］.J Exp Zool B Mol Dev Evol，2009，312（B）：320－42.

［6］ Miletich I，Sharpe P T.Normal and abnormal dental development［J］.Hum Mol Genet，2003，12（1）：69－73.

［7］ Das P，StochtonD W，Bauer C，et al.Haploinsufficiency of PAX9is associated with autosomal dominant hypodentia［J］.Hum Genet，2002，110（4）：371－6.

［8］ Wang J，JianF，Chen J，et al.Sequence analysis of PAX9，MSX1 and AXIN2 genes ina Chinese oligodontia family［J］.Arch Oral Biol，2011，56（10）：1027－34.

［9］ Zhang Y D，Chen Z，Song Y Q，et al.Making a tooth：growth factors，transcription factors，and stem cells［J］.Cell Res，2005，15（5）：301－16.

［10］Mostowska A，Biedziak B，Jagodzinski P P.Axis inhibition protein 2（AXIN2）polymorphisms may be a risk factor for selective tooth agenesis［J］.J Hum Genet，2006，51（3）：262－6.

［11］Vastardis H.The genetics of human tooth agenesis：new discoveries for understanding dental anomalies［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2000，117（6）：650－6.

Gene mutations in a Chinese family associated with oligodontia：A case-control study

Wang Jing1，2，Chen Jing2，3，Shen Yun1，et al
（1Dept of Stomatology，Shanghai Tenth People＇s Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200072；
2State Key Laboratory of Oral Diseases，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041；

3Laboratory of Oral Biomedical Science and Translational Medicine，Dept of Orthodontics，School of Stomatology，Tongji University，Shanghai 200072

ObjectiveTo investigate the mutation characteristics of paired box homeotic gene 9（PAX9），muscle segment homeobox gene 1（MSX1）and Axis inhibition protein 2（AXIN2）of patients with congenital oligodontia so as to understand the etiology and mechanism.MethodsThe proband and his family members from an ethnic Han family underwent complete physical and oral examinations（including panoramic radiograph）and received retrospective review.Blood samples were collected and polymerase chain reaction（PCR）was taken.Mutation analysis was employed in exon1，2，3，4 of PAX9，exon1，2 of MSX1 and exon 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 of AXIN2 coding regions.A case-control study on 50 subjects with sporadic tooth agenesis（cases）and 100 healthy controls was performed，which genotyped a novel AXIN2 gene polymorphism（G1807C）.ResultsThe patrilineal grandmother and the maternal grandfather of the proband were found siblings.The proband lacked all teeth except an impacted tooth in the left angulus mandibulae.Other family members maintained normal dentitions.No abnormalities were revealed by clinical examination of the family members，including orofacial cleft，ectodermal abnormalities of hair，skin and sweat glands.Three known AXIN2 gene variants，c.1365A＞G（rs9915936），c.1807G＞C（rs145353986）and c.2062C＞T（p.Leu688Leu）were identified in the proband and some of the family members. No mutation was found in PAX9 and MSX1.No significant difference was found in the allele and genotype frequencies of the novel variant between the subjects and controls.Conclusion Our findings may imply that the AXIN2 c.2062C＞T is a risk factor for congenital oligodontia in the Chinese population and there is no significant association between c.1807G＞C and congenital oligodontia.

non-syndromic congenital missing teeth；paired box homeotic gene 9；muscle segment homeobox gene 1；axis inhibition protein 2

R 780.2

1000－1492（2015）01－0070－05

2014－09－18接收

上海市衛生局科研項目（編號：20124Y049）

1同濟大學附屬第十人民醫院口腔科，上海 2000722口腔疾病研究國家重點實驗室四川大學華西口腔醫院，成都 6100413口腔生物醫學及轉化醫學實驗室同濟大學附屬口腔醫院正畸科，上海 200072

王 璟，女，主治醫師；賴文莉，女，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wenlilai＠scu.edu.cn