亳菊花中β-葡萄糖苷酶的提取和酶學(xué)性質(zhì)研究

亳菊花中β-葡萄糖苷酶的提取和酶學(xué)性質(zhì)研究

左亞鋒1，張偉1,2,3，吳德玲2,3，俞年軍1,2，金傳山1,2，劉勁松1,2,3，朱月健4，閆攀1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；2.安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥230012；

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物化學(xué)研究所，安徽 合肥230012；4.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州236000)

[摘要]目的測定亳菊花中β-葡萄糖苷酶的活性，研究亳菊花中β-葡萄糖苷酶的基本酶學(xué)性質(zhì)。方法采用對硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)法考察亳菊花中β-葡萄糖苷酶活性測定的最佳條件及其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果當(dāng)0.2 mL酶液、20 mmol/L pNPG 0.2 mL、0.6 mL pH值為4.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液在溫度為50 ℃的水浴中反應(yīng)45 min時，酶活性最高。在此條件下對亳菊花的粗酶液中β-葡萄糖苷酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明該酶在30～50 ℃時，隨著溫度升高，酶活力有上升趨勢，其熱穩(wěn)定性較好；pH值在3.2～5.4之間時，相對酶活性均在80%以上；酶在4 ℃下的保存穩(wěn)定性較好。結(jié)論本研究所測定的亳菊花中β-葡萄糖苷酶活性的最佳條件及酶學(xué)性質(zhì)可為亳菊花炮制原理研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]亳菊花；對硝基苯酚-β-D葡萄糖苷法；β-葡萄糖苷酶活性

[中圖分類號]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.024

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年項目(81303229)；安徽省自然科學(xué)

作者簡介：左亞鋒(1990-)，男，碩士研究生

收稿日期：(2015-05-06；編輯：張倩)

亳菊是臨床上常用的一味中藥，其性平，味甘，微苦，歸肺、肝經(jīng)，具有平肝明目、疏風(fēng)清熱的功效[1]。現(xiàn)代研究認(rèn)為，“疏風(fēng)”類中藥具有擴(kuò)張血管，促進(jìn)血液循環(huán)，降低血壓的作用，這一藥理作用與亳菊中黃酮類化合物藥理作用基本一致。植物中黃酮類化合物的合成、分解與溫度和植物體中酶密切相關(guān)[2-5]。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過烘干加工的亳菊中黃酮苷類成分較陰干樣品含量降低，而苷元含量則相對升高，初步推測其原因可能是加熱激活了亳菊中β-葡萄糖苷酶活性，由酶作用于亳菊中黃酮苷類成分，引起黃酮苷類化合物的分解。而亳菊在不同的加工炮制過程中，外在因素的改變就會對酶活性產(chǎn)生影響，從而使黃酮類化合物產(chǎn)生變化。因此，酶是影響亳菊質(zhì)量的一個重要因素。

通信作者：吳德玲，dlwu7375@sina.com

A Preliminary Study of Specification and Grade of Cortex Moutan

ZHANGYu-feng1,WANGJun2,3,FANGCheng-wu1,2,3,LIJing3,4,WUJi-hua4,5

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China;2.SchoolofPharmacy,BozhouVocationalandTechnicalCollege,AnhuiBozhou236800,China;3.BozhouInstituteofChineseMedicine,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiBozhou236800,China; 4.BozhouInstituteforFoodandDrugControl,AnhuiBozhou236800,China;5.BeijingTongrentangTraditionalChineseMedicinalMaterialsCo.,Ltd.inAnhui,AnhuiTongling244000,China)

Abstract[] ObjectiveTo explore the correlation of the accumulation of the main active ingredients in Cortex Moutan with the thickness and tissue structure of root, and to provide a scientific basis for quality evaluation of Cortex Moutan and its specification and grade classification. MethodsThe root system of five-year-old Paeonia ostii was collected, and the roots in the root system were classified according to thickness, length, and position. Commercially available Cortex Moutan with different specifications was collected from the market. The content of paeoniflorin and paeonal in each sample was determined using high-performance liquid chromatography. ResultsAmong Cortex Moutan of different grades, grade 4 Cortex Moutan had the highest content of paeoniflorin, while grade 1 Cortex Moutan had the highest content of paeonal. The content of paeoniflorin was lowest in the main root and highest in lateral roots. In the market, the unscraped Cortex Moutan had higher content of paeoniflorin but lower content of paeonal than the scraped Cortex Moutan. ConclusionThe thin Cortex Moutan has a relatively high content of paeoniflorin, suggesting that more paeoniflorin accumulates in the periderm. Due to the opposite trends in accumulation of paeoniflorin and paeonal, the quality standard of Cortex Moutan needs further studies.

[Key words] Cortex Moutan; root system ofPaeoniaostii; specification and grade; paeoniflorin; paeonal

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)屬于水解酶類，其能夠催化各類β-D-葡萄糖苷、二糖以及寡聚糖糖苷鍵的水解釋放葡萄糖和相應(yīng)的配基。自1837年Liebig和Wohler首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)該酶，其后研究中該酶被發(fā)現(xiàn)存在于自然界的許多植物中。植物來源的β-葡萄糖苷酶具有許多重要的生物學(xué)功能，董尚勝等[7-8]、趙芹等[9]對來源于茶葉、梔子花、茉莉花的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶在醇系香氣的形成中起到重要作用。但是由于不同來源的β-葡萄糖苷酶其酶學(xué)性質(zhì)也存在很大差異[10-11]，因此本課題組對新鮮亳菊中β-葡萄糖苷酶的酶活性進(jìn)行測定，并且對β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性進(jìn)行相關(guān)研究，為研究其在亳菊花炮制加工中的作用及其對亳菊花品質(zhì)的影響奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1儀器UV-759CRT紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；AB135-S型十萬分之一電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；AS-3120型超聲波清洗器：天津奧特賽恩斯公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇國勝實驗儀器廠；Heraeus Multifuge X1R離心機(jī)：美國賽默飛公司；SHB-Ⅲ水循環(huán)式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；MJ-BL25B31攪拌機(jī)：廣東美的精品電器制造有限公司。

1.2試劑亳菊采自亳州藥材基地，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)系劉守金教授鑒定為菊科植物亳菊Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. ‘Boju’ cv. nov.的花；對硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)：美國Sigma公司；對硝基苯酚、聚乙烯吡咯烷酮K-30(polyvinylpyrrolidone，PVP)、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；水為蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1β-葡萄糖苷酶粗酶提取液的制備稱取新鮮亳菊10.0 g，置于榨汁機(jī)中，加入少量石英沙，稱量與亳菊等量的PVP[11]，用適量預(yù)冷的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH值為4.0)溶解后加入榨汁機(jī)中，榨汁1 min成勻漿后于低溫下緩慢攪拌30 min后抽濾。抽濾液置于低溫冷凍離心機(jī)中12 000 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2β-葡萄糖苷酶活性測定[12-13]

2.2.1β-葡萄糖苷酶活性定義以pNPG為底物，在pH值為4.0，溫度為50 ℃的分析條件下，每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

2.2.2對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制對硝基苯酚含量用分光光度法測定。精密稱量139.1 mg對硝基苯酚，用1 mol/L Na2CO3溶液作為溶劑，配成濃度分別為0.001、0.005、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06 μmol/mL的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。以蒸餾水為空白，在400 nm波長處測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=21.049x，r=0.999 5。

在試管中加入0.2 mL pNPG，0.6 mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH值為4.0)和0.2 mL粗酶液，在50 ℃水浴條件下反應(yīng)45 min。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入2.5 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，在400 nm波長下測定其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出對硝基苯酚含量，然后換算得出酶活力。

2.3影響β-葡萄糖苷酶提取與活性因素考察

2.3.1β-葡萄糖苷酶提取液的類型及pH值對酶活性的影響酶是具有生物催化活性的生物大分子，穩(wěn)定性較差，酶的活性中心必須在特定的環(huán)境中才最容易與底物結(jié)合或具有最大的催化活性。本實驗用檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH值分別為3.4、3.8、4.0、4.4、4.8、5.0、5.4)，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH值分別為3.4、3.8、4.0、4.4、4.8、5.0、5.4)，按“2.2”項下方法提取，并按“2.3”項下方法用相應(yīng)的緩沖液進(jìn)行酶活性測定，測定不同類型的緩沖液及其pH值對酶活性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)提取液為pH值為4.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液時效果最好，酶活力達(dá)到最大。見圖1。

2.3.2底物濃度對酶活性的影響隨著底物濃度的升高，酶活性中心與底物結(jié)合的量越多，反應(yīng)速度增大，酶活性逐漸增大。但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時反而會對酶有抑制作用。這是因為酶活性中心結(jié)合過量的底物后，酶活性中心的基團(tuán)就不能針對一個底物進(jìn)行催化水解。本實驗按照“2.3”項下方法，其他條件不變，僅改變反應(yīng)體系pNPG濃度(分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L)，以測定反應(yīng)體系中pNPG濃度對酶活性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pNPG濃度達(dá)到20 mmol/L時，酶活性達(dá)到最大值。見圖2。

2.3.3反應(yīng)溫度對酶活性的影響溫度對酶活性影響較大。低溫時酶活性較低，隨著溫度升高，酶活性增大，但溫度過高又可能使酶變性。在一定條件下，酶活性達(dá)到最高時該溫度就是酶的最適溫度。本實驗按照“2.3”項下方法，其他條件不變，僅改變反應(yīng)體系溫度(分別為30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃)以測定反應(yīng)體系不同溫度對酶活性的影響。結(jié)果表明，最適溫度為50 ℃。見圖3。

2.3.4反應(yīng)時間對酶活性的影響酶活性是通過測定一定時間內(nèi)產(chǎn)物變化量而求得的，因此精確的計時很重要。按照“2.3”項下方法，其他條件不變，僅改變反應(yīng)體系時間(分別為15、30、45、60、75、90、105、120 min)以測定反應(yīng)體系的時間對酶活性的影響。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)時間是45 min。見圖4。

3　亳菊花中β-葡萄糖苷酶的基本酶學(xué)性質(zhì)

3.1酶的熱穩(wěn)定性將粗酶液加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，觀察其在不同溫度下(30～50 ℃)的水浴中反應(yīng)，定時取樣。按照“2.3”項下方法測定酶剩余活性變化，繪制熱穩(wěn)定性曲線。結(jié)果表明，該酶保存穩(wěn)定性較好。見圖5。

3.2酶的pH值穩(wěn)定性將粗酶液加入不同pH值檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，在4 ℃下靜置24 h。按照“2.3”項下方法測定剩余酶活力，繪制pH值穩(wěn)定性曲線。結(jié)果表明，該酶保存24 h相對酶活性均在80%以上，說明該酶pH值穩(wěn)定性較好。見圖6。

3.3酶的保存穩(wěn)定性將制好的粗酶液置于4 ℃冰箱中，定時取樣測定酶活性，繪制酶的保存穩(wěn)定性曲線。結(jié)果表明，酶活性隨著保存時間的延長下降幅度較小，保存至第10天時相對剩余酶活性仍在85%以上，說明此酶的保存穩(wěn)定性較好。見圖7。

4　討論

亳菊粗酶液提取過程中，緩沖液的種類和pH值對酶活性影響較大。實驗結(jié)果表明，亳菊β-葡萄糖苷酶提取時加入pH值為4.0的檸檬酸緩沖液提取效果最好；在對酶活性測定過程中發(fā)現(xiàn)，溫度、溶液pH值、底物濃度等都會影響其活性。實驗結(jié)果表明，當(dāng)酶促反應(yīng)溫度為50 ℃、pH值為4.0、底物濃度為20 mmol/L、反應(yīng)45 min時酶活性最高。熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，此酶在30～50 ℃下保存穩(wěn)定，隨著溫度升高，酶活性有上升趨勢。pH值穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，pH值穩(wěn)定性較好，pH值在3.2～5.4之間相對酶活性均在80%以上。保存穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，在4 ℃下低溫保存，酶的穩(wěn)定性很好，保存10 d相對剩余酶活性仍然在85%以上。

由于亳菊粗酶液是一個復(fù)雜的體系，其中許多夾雜的成分對其酶活性有激發(fā)或抑制作用，與純酶在性質(zhì)和作用表現(xiàn)上不完全一致。粗酶特性的研究結(jié)果并不能代表純酶的性質(zhì)，而只能是一個參考，因此有必要對該酶進(jìn)一步分離純化并研究其酶學(xué)性質(zhì)。通過研究β-葡萄糖苷酶在亳菊加工過程中對黃酮類化合物的影響，闡明不同加工方法通過影響該酶的活性對亳菊總黃酮化學(xué)成分、藥效及藥物代謝動力學(xué)產(chǎn)生影響的原因，通過調(diào)節(jié)控制炮制加工過程中影響酶活性的因素來控制亳菊中黃酮類有效部位的變化，在根本上保證藥材質(zhì)量，從而為亳菊制定合理的加工方法，為亳菊質(zhì)量的全面評價和臨床使用提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]林慧彬,鐘方曉,王學(xué)榮,等.菊花的本草考證[J].中醫(yī)研究,2005,18(1):27-29.

[2]Caldwell CR, Britz SJ, Mirechi RM. Effect of temperature, elevated carbon dioxie, and drought during seed development on the isoflavone content of dwarf soybean [Glycinemax(L.) Merrill] grown in controlled environments[J].J Agric Food Chem, 2005,53(4):1125-1129.

[3]梁迎暖,郭巧生,張重義,等.氣象因子對懷菊品質(zhì)影響分析[J].中國中藥雜志,2007,32(23):2474-2478.

[4]梁迎暖,郭巧生,張重義,等.懷菊花期次生代謝物含量及同功酶活性動態(tài)變化研究[J].中國中藥雜志,2007,32(3):199-202.

[5]李鵬亮,廖若宇,王旭,等.枸杞曬干過程中黃酮類化合物和苯丙氨酸解氨酶活性的變化[J].食品科學(xué),2014,35(23):79-83.

[6]金傳山,吳德玲,俞年軍,等.不同加工方法對亳菊黃酮類成分含量影響[J].中藥材,2012,35(5):702-704.

[7]董尚勝,童啟慶.梔子花中糖苷酶的分離及其醇系香氣形成的關(guān)系[J].浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2000,26(1):89-92.

[8]董尚勝,童啟慶，稻垣順?biāo)荆?茶用香花香氣形成機(jī)理研究報告(2)：茉莉花中β-D-葡萄糖苷酶活性的差異[J].福建茶葉,1998(4):9-10.

[9]趙芹,童啟慶.茶葉香氣水解酶研究動態(tài)[J].福建茶葉，1999(1):5-8.

[10]李華,高麗.葡萄漿果中β-葡萄糖苷酶活性測定條件的研究[J].釀酒科技,2007(8):146-149.

[11]宋曉青.臘梅花β-葡萄糖苷酶的活性分析、分離純化與性質(zhì)的初步研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005：5.

[12]江昌俊, 李葉云.茶葉中β-D-葡萄糖苷酶活性測定條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,26(2):212-215.

[13]李華,高麗.β-葡萄糖苷酶活力測定方法的研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2007,26(2):107-114.

Extraction and Enzymatic Properties of β-Glucosidase inChrysanthemummorifolium

ZUOYa-feng1,ZHANGWei1,2,3,WUDe-ling2,3,YUNian-jun1,2,JINChuan-shan1,2,LIUJin-song1,2,3,YANPan1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiKeyLaboratoryforModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceuticalChemistry,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

Abstract[] ObjectiveTo determine the activity of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium, and to study the fundamental enzymatic properties of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium. MethodsThe p-nitrophenyl-D-glucoside (pNPG) method was used to measure the optimal condition for determination of the activity of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium and its enzymatic properties. ResultsThe β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium had the highest activity when the mixture of 0.2 mL enzyme solution, 0.2 mL pPNG (20 mmol/L), and 0.6 mL citric acid-trisodium citrate buffer (pH 4.0) was incubated for 45 min in a 50 ℃ water bath. The fundamental enzymatic properties of β-glucosidase in the crude enzyme solution of Chrysanthemum morifolium were preliminarily studied under the above condition. The results showed that the enzymatic activity increased as the temperature increased from 30 ℃ to 50 ℃, suggesting a high thermal stability of the enzyme. The relative activity of the enzyme kept higher than 80% at pH 3.2-5.4. The enzyme was quite stable during storage at 4 ℃. ConclusionThe optimal condition for the activity of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium and its enzymatic properties determined in this study provide a basis for the processing principle of Chrysanthemum morifolium.

[Key words]Chrysanthemummorifolium; p-nitrophenyl-D-glucoside method; β-glucosidase activity