CREMτ在睪丸扭轉復位后生精功能損傷中的作用

汪清 吳詩瀟 韋思明? 潘杭麗

CREMτ在睪丸扭轉復位后生精功能損傷中的作用

汪清 吳詩瀟 韋思明? 潘杭麗

目的 環磷酸腺苷反應元件調控因子τ（CREMτ）是精子發生必不可少的轉錄因子。本研究探討CREMτ在睪丸扭轉復位后生精功能損傷中的作用。 方法 20只成年雄性SD大鼠隨機分為兩組，每組10只。對照組大鼠左側睪丸假手術。扭轉復位組大鼠左側睪丸扭轉，1h后復位。復位后3個月，行睪丸切除術，分析睪丸CREMτ表達和生精功能。 結果 單側睪丸扭轉復位引起同側睪丸CREMτ表達顯著降低，同側睪丸的生精功能也嚴重損傷。 結論 睪丸扭轉復位后生精功能損傷可能歸因于CREMτ表達降低。

睪丸扭轉 環磷酸腺苷反應元件調控因子τ 生精功能

睪丸扭轉又稱精索扭轉，在25歲以下男性的發病率為1/4000，并非少見［1］。復位是目前治療睪丸扭轉的主要方法。睪丸復位后雖然存活，但隨后出現睪丸萎縮，生精功能損傷。睪丸扭轉復位后的損傷機制仍然不明。環磷酸腺苷反應元件調控因子τ（CREMτ）是一個轉錄因子，在男性生殖細胞中的表達是其他組織的100倍，其調控著生精細胞特異基因的表達，促進精子發生的完成［2］。本研究探討CREMτ在睪丸扭轉復位后生精功能損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠（250～300g）由上海實驗動物中心提供。逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒購自Invitrogen公司。CREMτ與β-肌動蛋白的上、下游引物由上海生工生物工程公司合成。CREMτ抗體系Santa Cruz公司產品。β-肌動蛋白抗體來源于Sigma公司。

1.2 制作大鼠睪丸扭轉復位模型 20只成年雄性SD大鼠被隨機分為兩組，每組10只。將氯胺酮（50 mg/ kg）注入大鼠腹腔內麻醉，所有手術在無菌條件下實行。對照組：通過左側髂腹股溝切口取出左側睪丸。用11/0絲線穿過睪丸白膜，放睪丸入陰囊，關閉切口。扭轉復位組：通過同樣的切口暴露左側睪丸。將睪丸逆時針旋轉720°，在睪丸白膜與陰囊之間用11/0絲線縫合固定，保持睪丸扭轉狀態。1h后，拆除絲線，將睪丸反向旋轉到正常位置。睪丸恢復血供，仍然存活，放睪丸入陰囊內，關閉切口。復位后3個月，大鼠行雙側睪丸切除術，分析CREMτ表達和睪丸生精功能。

1.3 評估睪丸生精功能 睪丸切下后稱重，然后制作石蠟切片，蘇木素、伊紅染色（HE染色）。在顯微鏡下觀察曲細精管，測量曲細精管直徑、生精細胞層數，并行Johnsen評分。

1.4 檢測CREMτ mRNA和蛋白表達水平 用逆轉錄-聚合酶鏈反應的方法測定睪丸中CREMτ mRNA表達水平。CREMτ的上游引物是5'CCTCTGATGTGCCTGGTATT3'，下游引物是5'GCTGATTGTGCTGCATACTG3'，擴增長度是262bp。β-肌動蛋白作為內參照，它的上游引物是5'ACTGGCATTGTGATGGACTC3'， 下游引物是5'CAGCACTGTGTTGGCATAGA3'，擴增長度是453bp。用蛋白印跡法檢測睪丸中CREMτ蛋白表達水平。CREMτ條帶與內參照β-肌動蛋白的條帶密度比值代表CREMτ表達水平。

1.5 統計學分析 用GraphPad Prism 4.0軟件分析。數據以（x±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 睪丸生精功能 與對照組比較扭轉復位組同側睪丸（扭轉復位睪丸）的重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen評分明顯降低（P＜0.05）；兩組對側睪丸（即右側睪丸）的上述指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1 （A）兩組大鼠睪丸重量。（B）曲細精管直徑。（C）生精細胞層數。（D）Johnsen評分。斜線柱表示同側睪丸；空白柱表示對側睪丸。 與對照組比較，＊P＜0.05；與同組對側睪丸比較，﹟P＜0.05。

圖 2 睪丸組織學。（A）對照組雙側睪丸和扭轉復位組對側睪丸均顯示正常的曲細精管直徑和生精細胞層數。（B）延長的精子細胞（箭頭所指處）和成熟的精子（箭所指處）。（C）扭轉復位組同側睪丸顯示曲細精管萎縮和生精細胞層數減少。（D）生精細胞僅發育到早期精子細胞階段，也就是圓形精子細胞階段（箭所指處），缺乏延長的精子細胞和成熟的精子。所有圖片均HE染色，圖A和C放大100倍，圖B和D放大400倍。

2.2 睪丸CREMτ表達水平 扭轉復位組同側睪丸的CREMτ mRNA和蛋白表達水平與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組對側睪丸的CREMτ表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、4。

圖 3 對照組和扭轉兩組 （A）大鼠睪丸的CREMτ mRNA。（B）CREMτ蛋白表達水平。斜線柱表示同側睪丸；空白柱表示對側睪丸。 與對照組比較，＊P＜0.05； 與同組對側睪丸比較，﹟P＜0.05。

圖 4 兩組睪丸CREMτ表達分析。（A）用逆轉錄-聚合酶鏈反應的方法分析CREMτ mRNA表達水平。M表示DNA標記；N表示陰性對照（用去離子水代替cDNA）；1L和1R表示對照組左側（即同側）和右側（即對側）睪丸；2L和2R表示扭轉復位組同側和對側睪丸。β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照。（B）蛋白印跡法分析CREMτ蛋白表達水平。與對照組比較，扭轉復位組同側睪丸的CREMτ mRNA和蛋白表達水平顯著降低。兩組對側睪丸之間比較無明顯差異。

3 討論

睪丸扭轉是泌尿外科急癥，目前治療睪丸扭轉的主要方法是復位。如果睪丸扭轉后6h未治療，梗死將發生。睪丸扭轉患者即使在＜6h接受了復位手術，同側睪丸也會發生萎縮，生精功能障礙。本文動物實驗中，大鼠僅1h的睪丸扭轉，復位后雖然存活，但復位后3個月睪丸生精功能嚴重損傷。睪丸損傷的分子機制仍然不明。

CREMτ mRNA編碼CREMτ蛋白。CREMτ蛋白作為轉錄激活因子，激活生精細胞特異基因的轉錄［2］。因此，CREMτ是控制生精細胞分化的總開關。用同源重組技術使大鼠CREMτ基因突變，于是睪丸中CREMτ表達缺乏，導致大鼠睪丸重量減輕20%～25%，曲細精管直徑縮小20%～30%，精子發生阻斷在早期精子細胞階段，即圓形精子細胞階段，缺乏延長的精子細胞和成熟的精子［2］。由此可見，CREMτ表達對精子發生必不可少。本資料中單側睪丸扭轉復位引起同側睪丸精子發生嚴重損傷，表現為睪丸重量減輕，曲細精管直徑縮小，生精細胞層數減少，Johnsen評分降低。在受損傷的睪丸，生精細胞僅發育到圓形精子細胞階段，缺乏延長的精子細胞和成熟的精子。此外，受損傷睪丸的CREMτ表達水平也顯著降低。因為睪丸中CREMτ表達對精子發生必不可少，所以單側睪丸扭轉復位后同側睪丸生精功能損傷可能歸因于CREMτ表達降低。

單側睪丸扭轉復位是否會影響對側睪丸生精功能，目前仍有爭議。一些研究表明［3］，單側睪丸扭轉復位通過自身免疫、交感神經反射等機制引起對側睪丸損傷。而其他研究者認為［4］，單側睪丸扭轉復位未影響對側睪丸生精功能。本資料中，雖然單側睪丸扭轉復位導致同側睪丸CREMτ表達水平和生精功能顯著降低，但對側睪丸無任何改變。因此，單側睪丸扭轉復位未導致對側睪丸損傷。

總之，單側睪丸扭轉復位后，即使同側睪丸仍然存活，但它的精子發生嚴重障礙。睪丸CREMτ表達降低可能是引起生精功能損傷的原因。睪丸扭轉引起精索內血管受壓阻塞，導致睪丸缺血；復位使睪丸恢復血液供應。因此，睪丸扭轉復位后的損傷是一個缺血再灌注損傷。睪丸缺血再灌注后活性氧大量產生。活性氧能調控許多基因的表達［5］。單側睪丸扭轉復位后，同側睪丸CREMτ表達降低是否由活性氧引起，目前仍然不明，需要進一步研究來闡明。

1 Uyeturk U,Terzi EH,Gucuk A,et al. Prevention of torsion-induced testicular injury by Rhodiola rosea. Urology,2013,82(1):254.e1～6.

2 Kosir R,Juvan P,Perse M,et al. Novel insights into the downstream pathways and targets controlled by transcription factors CREM in the testis. PLoS One,2012,7(2):e31798.

3 Minutoli L, Antonuccio P, Squadrito F, et al. Effects of polydeoxyribonucleotide on the histological damage and the altered spermatogenesis induced by testicular ischaemia and reperfusion in rats. Int J Androl,2012,35(2):133～144.

4 ?ayan S,Saylam B,Tiftik N,et al. Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor,Y-27632,on oxidative stress,spermatogenesis,and apoptosis. Urology,2014,83(3):675. e13～18.

5 Kaminskyy VO,Zhivotovsky B. Free radicals in cross talk between autophagy and apoptosis. Antioxid Redox Signal,2014,21(1):86～102.

Objective The cAMP-responsive element modulator-τ（CREMτ）is an essential transcription factor for spermatogenesis. This study investigated role of CREMτ in spermatogenic injury after testicular torsion-detorsion. Methods Twenty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups，each containing 10 rats. Ten rats in control group underwent a sham operation of left testes. Ten rats in torsiondetorsion group received 1 hour of left testicular torsion. All rats underwent orchiectomy at 3 months after repair of torsion for analysis of testicular CREMτ expression and spermatogenesis. Results Unilateral testicular torsion-detorsion caused significant reduction in CREMτ expression in ipsilateral testes. The spermatogenesis in ipsilateral testes was also seriously injured. Conclusion Impairment of spermatogenesis after testicular torsiondetorsion may be due to reduction in CREMτ expression.

Testicular torsion cAMP-responsive element modulator-τ（CREMτ） Spermatogenesis

浙江醫學高等專科學校博士科研啟動基金資助項目（2008B05）

310053 浙江醫學高等專科學校

* 通訊作者