β-catenin在膽管細胞癌中的表達特點及其臨床意義

許遠 王兆洪 吳志豪 張偉?

·基礎研究·

β-catenin在膽管細胞癌中的表達特點及其臨床意義

許遠 王兆洪 吳志豪 張偉?

目的 探討連環蛋白（beta-catenin）在膽管細胞癌中的表達特點及其臨床意義。方法 檢測70例膽管細胞癌組織標本中betacatenin的表達水平，并與患者臨床、病理參數的相關性進行分析。結果 Beta-catenin在正常膽管組織及癌旁組織陽性表達率分別為6.67%（1/15）、9.09%（3/33）。Beta-catenin在膽管細胞癌中陽性表達率為57.14%，顯著高于正常膽管組織和癌旁組織（P＜0.05）。膽管細胞癌分化程度越高，beta-catenin的陽性表達率越高，高分化組與低分化組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。Beta-catenin的表達與患者年齡和淋巴結轉移有明顯相關性，年齡越大患者陽性表達率越高，有淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 Beta-catenin的表達程度隨腫瘤分化程度的增高而逐漸增強，beta-catenin可能參與腫瘤的浸潤及轉移，表達程度受年齡、有無淋巴結轉移等病理參數影響。

膽管細胞癌 連環蛋白 病理參數

膽管細胞癌（CC）是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，近年來，膽管細胞癌的發病率及病死率逐年上升［1］。Wnt/beta-catenin信號通路異常激活與腫瘤發生、發展有密切關系，連環蛋白（beta-catenin）是促進Wnt/ beta-catenin信號傳導異常的重要基因［2］。本研究通過檢測膽管組織癌變過程中beta-catenin的表達，并與膽管細胞癌患者臨床病理參數的相關性進行分析。現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 標本來源于本院2008年1月至2012年12月外科手術切除并經病理確診的膽管癌組織70例，其中男45例，女25例；年齡38～77歲，平均年齡為（55±6.7）歲。所有患者膽管癌均為原發病灶，術前均未接受化療、放療等治療，其中切除標本中帶有33例癌旁膽管組織標本，同時選取15例正常膽管組織標本。組織標本經10%中性甲醛溶液固定，并用常規石蠟包埋，5μm厚度常規連續切片，作HE及beta-catenin免疫組化染色。另一部分新鮮組織于-70℃低溫冰箱內放置保存，做進一步測試分析。70例膽管細胞癌組織標本中，肝內膽管癌（ICC）37例、肝外膽管癌（ECC）33例。膽管癌腫瘤類型：高分化腺癌27例、中分化21例、低分化22例。伴淋巴結轉移32例、無淋巴結轉移38例。

1.2 主要儀器及試劑 FinESSE 325型組織切片機（Shandon公司）、OLYMPUS/BX40顯微鏡（日本）、OLYMPUS 240 胃鏡（日本）、BM-II生物細胞包埋機（新安毅達）、冷凍切片機（德國萊卡）、TrionX-100曲拉通（Amresco）、隔水式電熱恒溫培養箱（上海醫用恒溫設備廠）。研究試劑：鼠抗人beta-catenin多克隆抗體試劑盒（Santa Cruz公司）、DAB染色試劑、蘇木素、甲苯胺藍、1%鹽酸酒精等均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 試驗方法 免疫組織化學染色：檢測組織中的beta-catenin的表達，經脫蠟水化及抗原高壓修復后將切片置于3%H2O2中浸泡30min進行封閉，PBS沖洗5min×3次，10%正常山羊血清，中和非特異性反應，濕盒內放置20min。滴加一滴稀釋后的一抗（betacatenin抗體，稀釋度為1：800）。并設置滴加PBS作為對照組，37℃恒溫箱內放置120min，取出，PBS洗3min×3次，吸去水分，滴加二抗工作液，于濕盒內37℃孵育60min。溫度設置為37℃條件下，于濕盒內孵育20min，此切片后經DAB底物顯色、蘇木素復染以及1%鹽酸酒精分化處理后，將切片置于顯微鏡下觀察及照相。

1.4 結果判定方法 Beta-catenin陽性染色主要在細胞內出現棕黃色顆粒，顯微鏡下觀察并確定染色最強的細胞表達部位，選擇多個視野，對每個視野內的陽性細胞所占百分率進行記錄，統計陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數，對beta-catenin的表達情況進行評分。染色強度及陽性細胞百分數均分為 0分、1分、2分、3分四個等級，分別代表基本無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色強染色以及陽性細胞比例≤10%、11%～25%、26%～50%、＞50%。兩項結果相加為最后結果，分別表示為-（0～1），+（2～3），++（4～5），+++（5～6），其中+、++、+++視為陽性。

1.5 統計學方法 使用SPSS 19.0軟件。組間均數比較采用t檢驗，組間率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膽管癌組織中的beta-catenin表達 beta-catenin在正常膽管與癌旁組織中的陽性表達率很低，兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。beta-catenin在膽管細胞癌中陽性表達率為57.14%，高于正常膽管組織和癌旁組織（P＜0.05）見表1。圖1為不同組織中的Betacatenin表達情況。

表1 正常膽管組織、癌旁組織及膽管細胞癌中的beta-catenin的表達［n（%）］

圖1 不同組織中的beta-catenin表達情況

2.2 膽管細胞癌中beta-catenin的表達與臨床參數關系 beta-catenin的表達與患者年齡、有無淋巴結轉移密切相關，年齡越大患者陽性表達率越高，有淋巴結轉移組陽性表達率與無淋巴結轉移組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。beta-catenin的表達程度在膽管細胞癌變發展過程中逐漸升高，膽管細胞癌分化程度越高，beta-catenin的陽性表達率越大，高分化組與低分化組比較差異有統計學意義（χ2=4.296，P=0.038＜0.05）。

表2 膽管細胞癌中的beta-catenin的表達與臨床參數關系［n（%）］

3 討論

膽管細胞癌是一種發病率較低，但病死率較高的惡性腫瘤，其癌細胞主要來自于肝內或肝外膽管上皮細胞［3，4］。Beta-catenin最初被認為是維持上皮細胞形態結構及細胞連接重要組成部分，目前研究發現betacatenin在細胞內Wn/beta-catenin信號通路異常激活起著重要的作用，從而介導細胞的發育、增殖、分化和癌變等生理及病理過程。Wnt/beta-catenin信號通路又稱經典Wnt信號通路，可促進多種腫瘤的發生發展。目前已經對Wnt/beta-catenin信號通路機制進行了比較清楚的研究［5，6］。缺少Wnt蛋白信號時，細胞內的bata-catenin與多種蛋白形成降解復合體，在泛素化的作用下而降解，從而將細胞內的beta-catenin維持在低水平狀態。當Wnt/B-catenin信號通路被激活時，抑制beta-catenin與APC等蛋白形成復合體，導致betacatenin不能被降解而造成積累，當積聚達到一定程度時，beta-catenin由細胞質進入細胞核內與轉錄因子LEF/TCF相結合，導致下游靶基因轉錄啟動，從而引發細胞增殖、分化異常而產生腫瘤。國內外已經研究證實，在乳腺癌［7］、甲狀腺癌［8，9］等腫瘤的發生和發展過程中，beta-catenin發揮著重要作用。

Beta-catenin基因在正常組織中幾乎不表達，正常肝組織排列整齊，Beta-catenin在細胞膜顯示清晰，少量分布在細胞漿內（圖1-A）。而在人類大多數腫瘤尤其是惡性腫瘤組織陽性表達率很高，胞膜分布不連續，細胞漿內有明顯的Beta-catenin積聚（圖1A～C）。Beta-catenin可使細胞-細胞之間的連接力減弱，且激活Wnt信號通路，導致腫瘤細胞的形成，促進腫瘤的發展轉移。本資料中，在正常的肝組織及膽管上皮組織中beta-catenin陽性表達率很低，在癌旁組織中的陽性表達率有所升高，beta-catenin在膽管細胞癌中陽性表達率達57.14%，顯著高于正常膽管組織和癌旁組織（P＜0.05）。beta-catenin在膽管細胞癌組織中，主要表達于細胞漿和細胞核內，而在細胞膜上表達較少，表明beta-catenin在膽管癌組織中的結構和功能發生改變，beta-catenin的粘附功能顯著減弱，Beta-catenin可作為膽管細胞癌發生腫瘤標志物。本資料發現高分化膽管細胞癌組中的beta-catenin陽性表達率顯著大于低分化組（P＜0.05）。Beta-catenin的表達強度對膽管細胞癌的惡性程度及發展趨勢有顯著影響，betacatenin可能參與膽管細胞癌細胞的進展與浸潤。這可能是因為beta-catenin的過量積聚，引起beta-catenin的多種復合體結構與功能異常，機體對癌細胞的約束力下降，轉移潛能升高，導致腫瘤轉移和浸潤。

有研究發現，臨床患者的年齡、性別及有無淋巴結轉移等臨床參數對腫瘤中的beta-catenin等基因表達有影響［10］。本資料中，beta-catenin表達與性別無顯著相關性，beta-catenin表達水平受患者年齡影響顯著，患者的年齡越大陽性表達率越高。有淋巴結轉移組陽性表達率顯著大于無淋巴結轉移組（P＜0.05），提示beta-catenin的表達可能與膽管癌細胞的淋巴結轉移有關。需進一步研究beta-catenin的表達影響因子及與其他相關基因的關系。

綜上所述，beta-catenin基因的高表達與膽管細胞癌的發生與發展有密切關系，beta-catenin基因的表達程度隨腫瘤分化程度的增高而逐漸增強。beta-catenin可能參與腫瘤的浸潤、轉移，表達程度受年齡、有無淋巴結轉移等因子影響，針對beta-catenin的表達進行全面檢測具有重要意義。

1 Sempoux C,Jibara G,Ward S C,et al.Intrahepatic cholangiocarcinoma: new insights in pathology. Seminars in Liver Diseases,2011,31(1): 49～60.

2 Farges O,Fuks D,Le Treut Y P,et al.AJCC 7th edition of TNM staging accurately discriminates outcomes of patients with resectable intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer,2011,117(10): 2170～2177.

3 Khan S A,Davidson B R,Goldin R D,et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma: an update. Gut,2012,61(12): 1657～1669.

4 張磊,畢新宇,趙平.肝內膽管細胞癌的外科治療進展. 中華肝膽外科雜志,2010,16(9): 718～720.

5 Ji J,Yamashita T,Wang X W.Wnt/beta-catenin signaling activates microRNA-181 expression in hepatocellular carcinoma. Cell Biosci, 2011, 1(1): 4.

6 占大錢,黃志勇,紀桂寶,等.N-cadherin,β-連環素在肝癌組織中的表達及與Wnt信號途徑的關系.中華實驗外科雜志,2011,28(9): 1473～1474.

7 Canel M,Serrels A,Frame M C,et al.E-cadherin–integrin crosstalk in cancer invasion and metastasis. Journal of Cell Science,2013,126(2): 393～401.

8 鐘春林,楊治力,伍波,等.β-catenin和cyclin-D1在散發性甲狀旁腺瘤的表達. 中華內分泌外科雜志,2012,6(4): 221～224.

9 Mao X,Chen D,Wu J,et al.Differential Expression of Fascin,E-cadherin and Vimentin: Proteins Associated With Survival of Cholangiocarcinoma Patients. The American Journal of the Medical Sciences,2013,346(4): 261～268.

10 冉住國,馮清林,宋毅,等. Beclin1和 Bcl2 在侵襲性垂體腺瘤中的表達及關系. 中華內分泌外科雜志,2012,6(4): 253～256.

Objective To explore the expression and signifi cance of beta-catenin in cholangiocarcinoma. Methods To detect the expression of beta-catenin in 70 cases of samples with cholangiocar cinoma. The relationship between beta-catenin and clinical pathologic parameters was analyzed. Results The positive rate of beta-catenin in normal bile duct and adjacent tissues was 6.67%（1/15）and 9.09%（3/33）respectively. The positive rate of beta-catenin in cholangiocarcinoma was 57.14% and it was signifi cantly higher than normal bile duct and adjacent tissues（P＜0.05）.The positive rate increased with the developing process of cancer. The high differentiation was higher than poorly differentiated. The expression of beta-catenin had a signifi cantly positive correlation with and clinical pathologic parameters（P＜0.05）.The positive expression rate of beta-catenin was higher in older patients. The positive expression rate of lymph node metastasis group was signifi cantly greater than the without group（P＜0.05）. Conclusion The expression of beta - catenin increases with the developing of tumor differentiation. The beta-catenin may take part in the tumor invasion and metastasis. The expression of beta-catenin has correlation with the pathological parameters，such as age and lymph node metastasis.

Cholangiocarcinoma Beta-catenin Clinical pathologic parameters

浙江省溫州市科技局基金項目（Y20120043）

325000 溫州醫科大學附屬第二醫院普外科

*通訊作者