大腸癌中Neuropilin-1的表達與血管生成的關系

蔡巧英 華漢巨

大腸癌中Neuropilin-1的表達與血管生成的關系

蔡巧英 華漢巨

目的 探討大腸癌組織中神經纖毛蛋白-1（NRP-1）的表達與大腸癌生物學行為及血管生成的關系和意義。方法 應用免疫組化SP 法檢測正常大腸黏膜、大腸癌組織中NRP-1、血管內皮生長因子（VEGF）、CD34的表達并測定微血管密度（MVD）。結果 大腸癌組織中NRP-1的表達及MVD高于正常大腸粘膜組織，且與大腸癌淋巴結轉移、浸潤程度密切相關。NRP-1表達陽性組的MVD高于陰性組。與VEGF表達呈正相關性。結論 NRP-1參與了大腸癌的發生、浸潤與轉移；NRP-1與大腸癌的血管生成有關；NRP-1作為腫瘤抗血管治療的靶點具有一定的價值。

大腸癌 神經纖毛蛋白-1 血管生成 免疫組化

大腸癌是常見的消化道腫瘤之一，隨著人們生活水平提高及飲食結構、生活方式的改變，我國大腸癌發病率呈上升趨勢。 神經纖毛蛋白-1（NRP-1）為collapsin/semaphorin 家族受體，在神經細胞導向、軸突生長方面發揮調節作用。近年研究發現，NRP-1可作為血管內皮生長因子（VEGF）家族成員的受體，在腫瘤血管新生方面發揮重要作用。作者通過檢測大腸癌組織中NRP-1、VEGF、CD34的表達并計數微血管密度（MVD），探討大腸癌組織中NRP-1的表達與血管生成的關系和意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集本院外科2010年1月至2013年10月手術切除并經病理檢查確診的大腸癌組織及正常大腸組織標本各52例，其中男31例，女21例；年齡48～76歲，平均年齡68歲。所有患者術前均未接受化療、放療及免疫等治療。腫瘤位于結腸13例、直腸39例。腫瘤分期按Dukes分期。鼠抗人NRP-1單克隆抗體購自英國Abcam公司，鼠抗人VEGF、CD34單克隆抗體及SP試劑盒均購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法 （1）免疫組化：采用免疫組化SP 法，嚴格按照試劑盒說明書操作。以PBS液代替一抗作為陰性對照，公司提供陽性片作為陽性對照。（2）陽性結果判斷標準：NRP-1、VEGF陽性染色信號為棕黃色或棕褐色顆粒，結果判定采用Volm雙評分法［1］，高倍視野下觀察每張切片染色均勻區陽性細胞著色強度及陽性細胞率，并分別進行分級記分，染色強度：0分：不染色；1分：輕度染色（淡黃色）；2分：中度染色（黃色）；3分：強染色（棕黃色或黃褐色）。陽性細胞率：1分：陽性細胞＜25%。2分：25%～50%。3分：＞50%。按上述兩項之和判斷結果：0分：陰性（-）。1～2分：弱陽性（+）。3～4分：陽性（++）。5～6分：強陽性（+++）。共計數 5 個視野，取平均值。（3）MVD計數：參照Krishnan等［2］的方法：CD34 陽性表現為血管內皮細胞呈棕色或棕黃色染色，以被染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為 1 個血管計數。低倍（×40）下觀察，確定3個血管著色最密集的區域，然后在高倍（×400）下計數這3個視野的微血管數，取其平均值為該片的MVD值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0 軟件處理。計數資料采用χ2檢驗、Fisher 精確概率法。MVD以（x±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間采用單因素方差分析。等級相關采用非參數Spearman 等級相關分析。 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌組織中NRP-1的表達情況及MVD比較 大腸癌組織中NRP-1主要表達于癌細胞胞膜上和胞質內，以胞質為主，呈棕黃色或棕褐色的顆狀物質，彌漫分布于整個胞質或沿胞膜周邊呈線狀分布。CD34標記大腸癌組織中微血管多集中于癌灶邊緣，血管缺乏完整性，管壁缺乏平滑肌。大腸癌組織中NRP-1陽性率為69.23%（36/52），MVD為（73.13±17.31），均明顯高于正常大腸組織的NRP-1陽性率3.85%（2/52）和MVD（22.32±5.25），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 正常大腸和大腸癌組織的NRP-1表達及MVD比較

2.2 NRP-1的表達與大腸癌臨床病理學特征的關系 在不同性別、年齡、腫瘤的部位、細胞分化程度的組別，差異無統計學意義（P＞0.05）；在腫瘤大小、淋巴結轉移與否、浸潤深度、不同Dukes分期組別比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2 。

表 2 大腸癌組織中NRP-1、VEGF的表達及MVD與臨床病理特征的關系（x±s）

2.3 大腸癌組織中NRP-1 的表達與 MVD 的關系 見表3。

Ochsenbein等［3］最先于1987年在非洲蟾蜍神經組織中發現的一種與神經生長導向有關的細胞膜表面I型跨膜糖蛋白，稱Neuropilin。NRP有兩個亞型：NRP-1和NRP-2，它們結構相似，約47%氨基酸序列同源。NRP為collapsin/semaphorin 家族受體，在神經細胞導向、軸突生長方面發揮調節作用。近年研究發現，NRP-1是VEGF亞型特異性受體，能與VEGF165結合，促進腫瘤新生血管生成。

很多腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等，都發現有NRP-1的表達。Hansel等［4］研究發現，NRP-1在一些消化道腫瘤發生和進展過程中，隨著腺體的發育異常從低到高，癌前病變組織中NRP-1表達強度和范圍隨之增加，提示NRP-1可能與消化道腫瘤的發生和發展有關。胡希宏等［5］對胃癌的研究也發現，NRP-1與淋巴結轉移及浸潤深度相關。本資料顯示，NRP-1在腫瘤≥5cm組、淋巴結轉移組、漿膜及漿膜外浸潤組的大腸癌組織中陽性率明顯升高，提示NRP-1的表達與大腸癌的腫瘤生長、淋巴結轉移及腫瘤浸潤有關。

新生血管的生成是腫瘤生長和轉移的基礎，腫瘤血管生成為腫瘤生長提供了必須的營養，促進腫瘤體積增大。另一方面，腫瘤組織內血管密度增加，促使腫瘤細胞進入血管發生轉移的幾率加大。MVD 反映了腫瘤組織的血管生成狀態，已廣泛應用于腫瘤血管生成的研究。腫瘤血管生成受多種血管生成因子和血管生成抑制物的調控，VEGF 是中心調控因子。NRP-1是VEGF165的復合受體，其生物學功能主要與VEGF165和VEGFR-2（血管內皮細胞表面受體）有關。AnaCatarina等［6］發現，內皮細胞協同表達NRP-1、VEGFR-2可加強VEGFl65與VEGFR-2的結合，增強VEGFl65介導內皮細胞趨化活性及有絲分裂原性。NRP-1是通過調節VEGF與VEGFR-2結合及其生物活性而影響VEGF誘導血管形成的［7］。Miao等［8］誘導前列腺癌細胞過度表達NRP-1的實驗發現，腫瘤體積顯著增大、腫瘤毛細血管密度增加、內皮細胞增殖、血管擴張。本資料顯示，NRP-1陽性表達組的MVD 顯著高于陰性組，表明NRP-1在大腸癌的血管生成中起促進作用。且大腸癌組織中NRP-1與VEGF共同陽性表達者占46.15 %，表達強度呈正相關。提示NRP-1促血管生成機制與VEGF有關。

綜上所述，作者認為NRP-1基因的過度表達在大

表3 大腸癌組織中NRP-1的表達與 MVD 的關系（x±s）

2.4 大腸癌組織中NRP-1、VEGF 表達的相關性 NRP-1與VEGF共同陽性表達者占46.15 %（24/52），表達強度呈正相關，r=0.27，P=0.02。

3 討論

腸癌的發生、發展過程中起一定作用，可作為評價大腸癌生物學行為的指標之一，NRP-1的表達與大腸癌的血管生成有關，因此NRP-1作為腫瘤抗血管治療的靶點具有一定的價值。

1 Conway EM, Zwerts F, Van Eygen V, et al.Survivin-dependent angiogenes is in ischemic brain:molecular mechanisms of hypoxiainduced up regulation.Am J Pathol.2003,163(3):935～946.

2 Krishnan Kulumani Mahadevan,Debdatta Basu,Swarup Kumar. Does CD34 Staining Reflect the Angiogenic Process in the Bone Marrow? An Analysis of a Series of Chronic Myeloid Leukemia Patients. J Clin Diagn Res. 2014, 8(5): FC04～FC07.

3 Ochsenbein AM,Karaman S,Jurisic G,et al. The role of neuropilin-1/ semaphorin 3A signaling in lymphatic vessel development and maturation. Advances in Anatomy Embryology and Cell Biology.2014,214:143～152.

4 Hansel DE,Wilentz RE,Yeo CJ,et al.Expression of neuropilin-1 in high-grade dysplasia,invasive cancer,and metastases of the human gastrointestinal tract. Am J Surg Pathol. 2004,28(3):347～56.

5 胡希宏,王云忠,金桂龍,等. Neuropilin-1與胃癌發生、發展及血管生成的關系.浙江醫學.2013,35(5):347～350.

6 Ana Catarina PL,Susana P,Mamede C. Roles of Vascular Endothelial Growth Factor in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Biomed Res Int. 2014,947513.

7 Neufeld G,Cohen T,Gengrinovitch S,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors.FASEB J.1999,13(1):9～22.

8 Miao H Q,Lee P,Lin H,et al.Neuropilin-1 expression by tumor cells promotes tumor angiogenesis and progression. FASEB J. 2000,14(15):2532～2539.

Objective To explore the expression of Neuropilin-1（NRP-1） in colorectal carcinoma tissue，analyze and identify the relationship between the expression and tumor angiogenesis together with biological behaviour in colorectal carcinoma. Methods SP immunohistochemical method was performed to detect the expression of NRP-1，VEGF and CD34，the value of microvascular density（MVD）in surgically resected colorectal carcinoma specimens and normal colorectal tissues was evaluated.Results The positive expression of NRP-1 and CD34 in colorectal carcinoma specimens were signifi cantly higher then in normal colorectal tissues，and also the expression and MVD were closely related to lymph node metastasis and depth of invasion. The MVD in the groups of NRP-1 positive-expression were signifi cantly higher than in negative-expression groups. There were positive correlations between the expression of NRP-1 and VEGF in colorectal carcinoma. Conclusions The expression of NRP-1 is participated to the invasion and metastasis of colorectal carcinoma. NRP-1 is participated to the tumor angiogenesis on colorectal carcinoma. NRP-1 can be selected as target for tumor anti-angiogenesis treatment.

colorectal carcinoma Neuropilin-1 Angiogenesis Immunohistochemistry

322109 浙江省東陽市人民醫院外科（蔡巧英）

310009 浙江大學醫學院附屬第一醫院肛腸外科（華漢巨）