微波輔助提取玉米蛋白粉中的玉米黃色素研究

趙文揚， 康明麗， 郭小磊， 王蕾娜

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018）

玉米蛋白粉也稱為玉米麩質粉，是加工玉米淀粉的副產物之一（趙文揚等，2014），其中主要成分是玉米醇溶蛋白和玉米黃色素。玉米黃色素是主要由β-胡蘿卜素、玉米黃素（3-3’-二羥基-β-胡蘿卜素）、黃體素（3-3’-二羥基-α-胡蘿卜素）和隱黃素（3-羥基-β-胡蘿卜素）組成的類胡蘿卜素混合物，其中雙羥基胡蘿卜素的比重最大，其次是單羥基胡蘿卜素 （Quackenbush等，1970）。玉米蛋白粉中類胡蘿卜素含量為100～300 mg/kg（李麗和崔波，2010）。研究表明，玉米黃色素可以增強免疫力，降低患癌癥、心血管疾病、眼部疾病和白內障等風險（孫曉芳等，2010；吳靜等，2009；孫震等，2006a、b）。 提取玉米蛋白粉中玉米黃色素的方法主要有混合有機溶劑萃取、超臨界CO2萃取、微波法等（周芳和郝紅英，2014）。有機溶劑法使用的提取設備較為常用；超臨界CO2萃取需要特殊的設備，儀器設備昂貴，而且分離步驟繁雜；微波輔助可以消除熱梯度，具有速度快、能耗低、提取質量高等優點，有利于工業化大規模生產。黃瓊等（2011）利用微波輔助提取玉米黃色素，提高了提取率，但是微波時間過長，會破壞玉米黃色素的結構。

因此，本試驗利用分析軟件Design expert 8.0.6進行Box-Benhnken試驗設計，對微波提取玉米蛋白粉中玉米黃色素的提取條件進行優化，為工業化提取提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 玉米蛋白粉：河北誠業制糖有限公司提供；β-胡蘿卜素購于美國Sigma公司；無水乙醇、二氯甲烷等試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備 T6新世紀紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）、PL203電子分析天平 （梅特勒-托利多儀器有限公司）、MP511型實驗室pH計（上海三信儀表廠）、Galanz G8023 YSL-V1微波爐 （佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-胡蘿卜素最大吸收波長的確定 準確稱取20 mg β-胡蘿卜素，溶解于100 mL無水乙醇中。以無水乙醇做空白參比，在紫外可見分光光度計400～600 nm波長處進行掃描，確定最大吸收波長 λmax。

1.3.2 標準曲線的制作 準確稱取20 mg β-胡蘿卜素，配制成濃度為0.2 mg/mL的標準溶液，分別吸取1～8 mL，用無水乙醇定容至50 mL。在λmax處測其吸光度值，用最小二乘法做線性回歸，得標準曲線（圖1）及標準曲線回歸方程。

圖1 β-胡蘿卜素的標準曲線

由圖1可知，標準曲線的回歸方程為：

y=24.128x+0.0248，相關系數R2=0.9992；

式中：y為吸光度；x為β-胡蘿卜素濃度，mg/mL。

1.3.3 提取溶劑的選擇 準確稱取2 g玉米蛋白粉，分別溶于20 mL無水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑中，pH值調至5，靜置提取1 h后過濾，在λmax處測其吸光度值并計算得率。

1.3.4 單因素試驗 準確稱取2 g玉米蛋白粉按料液比 1∶20～1∶4（g/mL）溶于有機溶劑（無水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等）中，分別調節pH值至2～13，微波功率 160、320、480、640、800 W，微波時間10～60 s。提取完成后，過濾，在λmax處測其吸光度值，計算得率。由于微波會產生大量的熱，破壞色素的穩定性，所以提取時間不宜過長。

1.3.5 玉米黃色素的得率計算 在λmax處測得吸光度值，根據標準曲線求得玉米黃色素中β-胡蘿卜素含量（mg/mL），利用公式計算玉米蛋白粉中玉米黃色素的提取率。

玉米黃色素的得率/（mg/g）=稀釋倍數×C×V/所用的玉米蛋白粉質量（g）；

式中：C為β-胡蘿卜素含量，mg/mL；V為提取液的體積，mL。

1.3.6 優化試驗 在單因素試驗的基礎上，根據Design Expert 8.0.6進行三因素三水平的Box-Benhnken響應面試驗設計，以料液比、pH值和微波設定為研究因素，以玉米黃色素的得率為響應值。

1.4 數據統計分析 試驗處理重復三次，試驗結果均以平行試驗測定所得數據的 “平均值±標準差”表示。處理間的平均數多重比較用SPSS 17.0統計軟件中的Duncan’s分析法，最小差異顯著水平為5%。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長 由圖2可見，波長掃描結果顯示β-胡蘿卜素在波長為446 nm處有最大吸收峰。將提取液進行波長掃描，得到最大吸收波長為446 nm。這與張梅秀等（2013）和李曉玲等（2014）的研究結果相同。

圖2 β-胡蘿卜素最大吸收波長的確定

2.2 提取溶劑的選擇 由圖3可知，用不同提取溶劑提取玉米黃色素，得率由大到小分別為：二氯甲烷＞無水乙醇＞乙酸乙酯＞氯仿＞四氯化碳＞丙酮＞石油醚＞正己烷。從圖3可以看出，無水乙醇與二氯甲烷對玉米黃色素得率的影響無顯著差異（P>0.05）。由于二氯甲烷和乙酸乙酯具有刺激性氣味，而無水乙醇具有特殊的香味且易揮發，適用于食品加工，所以選擇無水乙醇為最佳提取溶劑。李曉玲等（2014）通過溶劑篩選，選擇無水乙醇作為提取溶劑提取玉米黃色素。敬思群等（2010）通過溶劑篩選，選擇成本較低，易于濃縮蒸發且易回收利用的無水乙醇作為玉米蛋白粉中黃色素的提取劑。

圖3 提取溶劑的選擇

2.3 pH值對玉米黃色素得率的影響 由圖4可知，pH值的變化對玉米黃色素得率的影響顯著（P<0.05）。隨著pH值的升高，玉米黃色素的得率逐漸增加，在pH為5時達到最大，隨后逐漸減小。由于玉米黃色素在弱酸性和中性范圍內比較穩定（敬思群等，2010），因此，提取玉米黃色素的最佳pH為5。

圖4 pH值對玉米黃色素得率的影響

2.4 料液比對玉米黃色素得率的影響 由圖5可知，料液比的變化對玉米黃色素得率的影響顯著。隨著料液比例的逐漸減小，玉米黃色素的得率逐漸增加，1∶6時得率最大，隨后又減小，因此最佳料液比選擇 1∶6。

圖5 料液比對玉米黃色素得率的影響

2.5 微波功率對玉米黃色素得率的影響 由圖6可知，微波功率的變化對玉米黃色素得率的影響顯著。隨著微波功率的增加，玉米黃色素的得率逐漸增加，到640 W時得率最大，640 W之后得率緩慢減小。微波加熱主要是通過穿透水將能量傳遞到植物物料內部使細胞內溫度突然升高，連續的高溫使其內部壓力超過細胞空間膨脹的能力，從而導致細胞破裂，細胞內的物質自由流出，傳遞到周圍被溶解。所以在一定時間內微波功率越大傳遞能量就越多，植物因細胞破裂而溶出的內容物也越多。但是功率過大會分解色素（張守文和韓英，2014）。因此最佳微波功率為640 W。

圖6 微波功率對玉米黃色素得率的影響

2.6 微波時間對玉米黃色素得率的影響 由圖7可知，隨著微波時間的延長，玉米黃色素的得率逐漸增加，達到一個最大值之后緩慢減小，可能是由于微波放熱的過程中，隨著微波時間的延長，微波產生的熱量逐漸破壞玉米黃色素的結構，使玉米黃色素分解，玉米黃色素得率逐漸減小。姚壯和（2013）認為利用微波輔助法來提取色素，應當把微波功率和作用時間兩個因素結合，在單因素試驗基礎上進行提取條件的優化，以確定最佳提取條件。

圖7 微波時間對玉米黃色素得率的影響

2.7 優化試驗 根據單因素試驗結果，設定料液比為 1∶8～1∶4（g/mL），pH 值為 4～6。 由于在微波初期，微波功率為640 W時，微波20 s，玉米黃色素得率最大，微波功率為640 W，微波15、25 s和微波功率為480 W，微波25 s，玉米黃色素得率差異不顯著（P>0.05），因此選擇微波功率大且時間短的微波條件，當時間相同時，選擇微波功率較小的微波條件，以減少玉米黃色素的損失。因此選擇微波條件分別為640 W、15 s，640 W、20 s和480 W、25 s。試驗因素和水平見表1；試驗安排及結果見表2；回歸模型的方差分析見表3。

表1 Box-Behnken響應面設計試驗因素與水平

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

經分析得到的得率Y對料液比、pH值和微波條件的二次多元回歸方程如下：

Y=0.26-0.003021A+0.001399B+0.002965C-0.004588AB-0.001007AC+0.0006714BC-0.049A2-0.038B2-0.039C2。

表3的方差分析結果表明，方程復相關系數的平方 R2=0.9981，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05）。 R2adj為0.9956，表明建立的模型能解釋99.56%響應值的變化，能很好地描述玉米蛋白粉中的玉米黃色素的得率隨提取條件的變化規律。因此該模型可用于預測響應值。

此外，由表3還可以看出，因素A、B、C對玉米黃色素的得率的影響極顯著（P＜0.01）。

響應面圖及等高線圖見圖8～10，各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過該組圖直觀反映出來。等高線的形狀反映了交互作用的強弱，橢圓表示兩兩交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。

圖8 料液比（A）與pH（B）響應面圖和等高線

圖9 料液比（A）與微波條件（C）響應面圖和等高線

由圖8可以看出，料液比和pH的交互作用顯著，隨著料液比和pH的增加，得率逐漸增加，但是料液比和pH過高，得率下降，因此料液比為1∶6左右，pH為5左右，得率最大。

由圖9可以看出，料液比和微波條件的交互作用不顯著，隨著料液比的增加，微波條件的改變，得率逐漸增加，但是料液比過高，微波功率減小微波時間增加，得率下降，因此料液比為1∶6左右，微波條件為640 W、20 s左右，得率最大。

由圖10可以看出，pH和微波條件的交互作用影響不顯著，隨著pH的增加，微波條件的改變，得率逐漸增加，但是pH過高，微波功率減小微波時間增加，得率下降，因此pH為5左右，微波條件為640 W、20 s左右，得率最大。

2.8 驗證試驗 通過優化分析得到的最佳提取條件料液比為1∶6，pH值為5，微波功率640 W，微波時間20 s。進行驗證試驗，得到玉米黃色素的得率為0.2650 mg/g，與預測值接近。

3 結論

通過響應面建立了料液比、pH值以及微波條件三因素的回歸模型，根據響應面優化結果，得到最優的工藝參數為料液比 1∶6，pH值 5，微波功率640 W，微波時間20 s，玉米黃色素的得率為0.2650 mg/g。建立的回歸模型方程能夠很好地反映玉米黃色素的提取條件與玉米黃色素得率的關系，同時確立了提取玉米黃色素的最優條件。本文研究結果可以為玉米黃色素的工業化提取提供參考依據。

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