納豆芽孢桿菌發酵制備高蛋白微生態血粉的研究

潘春梅， 李彥紅， 袁麗娟

（1.河南牧業經濟學院生物工程系，河南鄭州 450046；2.鄭州大學化學與分子工程學院，河南鄭州 450052；3.鄭州市農產品質量檢測流通中心，河南鄭州 450006）

動物血液中蛋白質含量高，可作為畜禽蛋白質飼料來源。但是由于加工成本高，設備不配套以及血粉中蛋白質分子量大、難消化、適口性差等原因，造成血粉資源大量浪費，而且嚴重污染環境（方俊等，2006）。目前利用微生物發酵方法對血粉進行處理，可不同程度解決血粉消化率低、氨基酸平衡性差、功能單一等問題。如能利用現代生物技術手段，利用益生菌將血粉進行微生物發酵，在提高其蛋白消化利用率和適口性的同時，增加益生菌的數量，制備高效的高蛋白微生態血粉，對于改善動物的健康狀況有著重要意義。因此，本試驗選擇具有較高蛋白酶活力和顯著益生特性的納豆芽孢桿菌作為發酵菌株，利用響應面方法對微生態血粉的發酵工藝參數進行了優化。

1 材料與方法

1.1 菌種 納豆芽孢桿菌 （Bacillus natto ZZ18）由河南牧業經濟學院微生物實驗室分離保存。

1.2 原料 血粉由河南君安生物科技有限公司提供，豆粕粉由鄭州天宇飼料科技有限公司提供，粗蛋白質含量分別為79.3%、43.2%。

1.3 培養基 斜面培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。種子培養基：營養肉湯培養基，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，121℃滅菌15 min。血粉發酵培養基（g/L）：蔗糖 10，玉米粉 10，血粉 100，豆粕粉10，初始pH自然，裝液量50 mL/250 mL三角瓶，115℃滅菌30 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 發酵培養 接一環已經活化的納豆芽孢桿菌至種子培養基中，30℃、200 r/min培養24 h。將擴大培養過的納豆芽孢桿菌加入到滅菌后的血粉發酵培養基中，在一定條件下恒溫振蕩培養72 h。取出培養液，測定細菌總數、游離氨基酸含量、可溶性蛋白質含量，并計算水解度。每個樣品做3個平行樣。

1.4.2 發酵優化試驗設計 采用Box-Benhnken試驗設計對發酵條件進行三因素三水平的響應面分析試驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。以發酵溫度（X1）、接種量（X2）、搖床轉速（X3）為自變量，經過下述公式分別進行編碼轉換：X1=（X1-34）/4；X2=（X2-6）/2；X3=（X3-180）/40。響應面優化回歸分析模型為：

式中：β0、βi、βii和 βij分別是截距及回歸系數；xi、xj是編碼轉換后的自變量；響應值Y為血粉的水解度。試驗設計見表1和表2，利用Minitab軟件對響應值和自變量之間的關系進行擬合統計分析。

表1 中心組合試驗設計的因素與水平

表2 中心組合試驗設計安排及不同發酵條件下血粉的水解度

1.4.3 水解度的測定 取血粉發酵液10 mL，加入質量分數10%三氯乙酸10 mL，混勻后靜置30 min，4℃、10000 r/min離心 15 min，半微量凱氏定氮法測定上清液中三氯乙酸（TCA）可溶氮含量。分別測定血粉發酵前總氮含量以及發酵前后可溶性氮含量，按以下公式進行計算：

水解度 （DH）/%=（發酵后的可溶性氮含量-發酵前的可溶性氮含量）/發醇前總氮含量×100。

1.4.4 游離氨基酸總量的測定 采用茚三酮法測定游離氨基酸總量（龐偉，2009）。

1.4.5 蛋白酶活性測定 蛋白酶活性采用Folin酚法測定，酶活定義為1 mL酶液在40℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1 μg酪氨酸所需的酶量為1個活力單位（龐偉，2009）。

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌發酵血粉工藝條件的響應面優化 在納豆芽孢桿菌發酵血粉的過程中，發酵溫度、接種量和轉速都會影響納豆芽孢桿菌的生長和血粉的水解。利用Box-Benhnken試驗設計研究發酵溫度（X1）、接種量（X2）、轉速（X3）對納豆芽孢桿菌血粉發酵水解度的影響。利用統計軟件MINITAB14.11對血粉水解度DH（表2）進行二次多項回歸擬合和數據分析，建立最佳血粉發酵條件的二次響應面回歸模型。由表3可知，擬合的三元二次方程為：

式中：X1、X2和X3分別代表發酵溫度、接種量和搖床轉速的編碼水平；Y1代表血粉水解度預測值。

為檢驗方程的有效性，對血粉水解度的數學模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，一次項 X1、X3極顯著（P ＜ 0.01），X2不顯著，表明發酵溫度和轉速對血粉的水解具有較大的影響。二次項中 X12、X22、X32均具有顯著差異（P ＜ 0.1）。 交互項X1X2、X1X3、X2X3均不顯著，說明發酵溫度和接種量、發酵溫度和轉速、轉速和接種量的交互作用對發酵血粉無顯著影響。

為檢驗方程的有效性，對水解度DH的數學模型進行方差分析，結果見表4。由表4可知，二次回歸模型的F值為15.06，相應的概率值P＜0.004，模型決定系數R2=0.964，表明該模型回歸顯著，說明該模型對試驗結果擬合程度較好，試驗誤差小，預測值和實測值之間具有高度的相關性，較好地反映了血粉水解度DH與發酵溫度、接種量、轉速的關系，因此可以用此模型對納豆芽孢桿菌發酵血粉水解度進行分析和預測。

表3 Box-Benhnken試驗對血粉水解度的回歸分析結果

表4 血粉水解度回歸方程的方差分析

為了求得發酵血粉的最佳培養條件，對所得的回歸擬和方程分別對各自的變量求一階偏導，并令其為0，得到三元一次方程組，求解此方程組得出該模型的極值點：X1=0.6449、X2=0.1309、X3=0.5532、Y=29.2，即當發酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉速為202 r/min時，發酵血粉的理論最大DH值為29.2%。

根據獲得的回歸方程，利用Minitab繪出不同發酵條件下發酵血粉水解度的響應面分析圖及其等高線圖，見圖1至圖3。每個響應面分別代表兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳值水平，由響應面圖可以看出：所有的響應面圖均呈現明顯的峰值，這意味著最佳的發酵條件在試驗設計的考察范圍內，其中溫度對發酵血粉水解度的影響最為顯著，當轉速和接種量固定在最佳水平時，發酵溫度在30～36.6℃，發酵血粉的水解度隨著發酵溫度的升高而顯著提高，當溫度高于36.6℃時，水解度降低。當發酵溫度和接種量固定在最佳水平時，轉速由140 r/min增至202 r/min，發酵血粉的水解度則隨之提高。這是因為在適當的發酵溫度和溶氧水平下，納豆芽孢桿菌能產生較高活力的蛋白酶，將血粉蛋白中的高分子物質水解。同時，由相應的等高線圖可以看出，在圖1至圖3中的等高線圖接近圓形，交互作用均不顯著。

圖1 溫度和轉速對發酵血粉水解度的影響（接種量固定為6.6%）

圖2 接種量和轉速對發酵血粉水解度的影響（溫度固定為36.6℃）

圖3 接種量和溫度對發酵血粉水解度的影響（轉速固定為202 r/min）

2.2 納豆芽孢桿菌發酵血粉最佳發酵條件驗證試驗 根據求得的最優回歸方程和試驗結果，得到發酵血粉水解度達最大值時的組合為：發酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉速為202 r/min。在此優化條件下進行驗證試驗，搖瓶培養試驗測得的數據為29.1%±0.2%（n=5），試驗值與理論預測值非常接近，可見該模型可以較好地預測實際發酵情況，從而也證明了響應面法優化血粉發酵條件的可行性。

2.3 發酵血粉的組分分析 血粉與玉米粉、豆粕粉等混合物料經納豆芽孢桿菌發酵后，發酵液外觀為淡紅色，具有發酵血液特殊醇香，無明顯血腥味和不良異味，室溫下保存6個月不變質。經納豆芽孢桿菌發酵后，發酵液中可溶性氮含量由發酵前的0.35 g/L增加至4.24 g/L，游離氨基酸含量由發酵前的0.17 g/L增加至1.09 g/L，發酵液中的蛋白質含量下降了29%，蛋白酶活力達到1576 U/mL。這說明納豆芽孢桿菌在發酵過程中分泌了大量蛋白酶，將血粉中的大分子量蛋白質降解成氨基酸和小分子量的肽類，從而導致總蛋白質含量下降，可溶蛋白與游離氨基酸含量上升。另外，發酵過程中納豆芽孢桿菌大量生長，產生的菌體蛋白被水解也可提高發酵血粉的氨基酸含量，改善其氨基酸組成和產品風味。發酵血粉蛋白的可降解性大大提高，產物中含有大量的納豆芽孢桿菌活菌體（8.8×108cfu/mL），并具有較高的蛋白酶活力，可作為潛力巨大的高蛋白益生產品使用（表5）。

表5 血粉發酵液的成分分析

3 結論

3.1 利用Box-Behnken試驗設計建立影響發酵血粉水解度的二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，獲得最佳發酵條件為：發酵溫度36.6℃、接種量6.6%、轉速202 r/min。在優化條件下經5批搖瓶培養試驗驗證，預測值與驗證試驗平均值接近，與原始培養條件相比，水解度提高了42.3%，達到29.1%。

3.2 血粉經納豆芽孢桿菌發酵后，氣味有所改善，發酵液中可溶性氮和游離氨基酸含量分別增加至4.24 g/L和1.09 g/L，蛋白質含量下降了29%，蛋白酶活力達到1576 U/mL，納豆芽孢桿菌活菌數量達到8.8×108cfu/mL，具有良好的營養價值和益生特性。

[1]方俊，盧向陽，蔣紅梅，等.響應面分析法優化制備豬血小肽發酵條件的研究[J].食品科學，2006，27（8）：141～144.

[2]龐偉.豬血多肽的發酵法制備及其ACE抑制活性研究：[碩士學位論文][D].合肥：合肥工業大學，2009.