一株兔源枯草芽孢桿菌的分離鑒定及產酶能力研究

龍 淼， 何潤霞， 劉敏月， 于 丹， 邵啟冰， 童柳蔭， 李松菲， 高增貴

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農牧機械研究所有限公司，遼寧沈陽110036；3.沈陽工學院經濟與管理學院，遼寧撫順113112；4.沈陽農業大學植物保護學院，遼寧沈陽 110866）

本試驗采用傳統培養與分子生物學技術相結合的方法對兔腸道中菌株進行了分離和鑒定，并對其產酶能力和安全性進行了研究，為研制適用于兔的微生態制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 GelDoc XR+凝膠成像系統（美國Biorad公司）；S1000型 PCR 儀（美國伯樂）；PowerPac Basic型電泳儀 （美國伯樂）；Legend Micro 17R小型冷凍離心機 （美國Thermo Scientific）；VS-1渦旋振蕩器 （北京鼎昊源科技有限公司）；CC6小型離心機 （北京鼎昊源科技有限公司）；DYCP-31DN水平電泳槽（北京六一）；SW-CJ-1F型超凈工作臺 （蘇州安泰）；THZ-98c恒溫搖床（上海一恒）；DNP-9162普通培養箱（上海精宏）；ldzx-50kds高壓蒸汽滅菌器 （上海申安醫療器械廠）；DHG-9075A電熱恒溫干燥箱（上海一恒）。

1.2 試驗材料 PCR Mix試劑盒、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，購自上海生工；PCR引物由上海生工合成；LB固體培養基、LB液體培養基；改良GAM肉湯、纖維素酶選擇培養基購自青島海博生物技術有限公司；生化試劑、微量生化管等，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液，購自青島海博生物技術有限公司；TE緩沖液（自配）；溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（SDS）、DL2000Marker電泳級瓊脂糖，購自上海生工）；家兔購自沈陽某養殖場。淀粉酶選擇培養基、蛋白酶選擇培養基根據任香蕓等（2007）、于萍和勵建榮（2006）、戴玄等（1997）的方法配制。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌分離 無菌采取家兔腸道內容物，分段收集腸道內容物 （十二指腸、空腸、回腸和盲腸），用無菌棉簽沾取腸道內容物，迅速將其加入到含有20 mL滅菌水的滅菌三角瓶內，搖動片刻，然后小火加熱至懸液沸騰，維持2 min。然后靜止5 min，吸取上層液0.1 mL，涂布于LB固體培養基，用封口膜將平皿封好，倒置于厭氧培養罐中，迅速放入厭氧袋并蓋好蓋，厭氧培養48 h，挑取單菌落，于改良GAM肉湯進行厭氧培養，觀察培養特性，進行革蘭氏染色，選取疑似芽孢桿菌的菌株進行下列試驗。

1.3.2 生化鑒定 抑菌效果好的菌株用改良GAM肉湯培養，轉移接種于生化反應管，根據杭州天和微生物試劑有限公司 《細菌微量生化反應管使用說明書》觀察反應結果。主要鑒定項目：接觸酶試驗、脲酶試驗、糖醇類發酵試驗、硝酸鹽還原試驗、H2S產生試驗等。

1.3.3 16SrRNA序列測定及同源性分析 16Sr-RNA序列測定引物采用通用引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。分離株進行基因組DNA提取，基因組DNA的提取采用生工柱式細菌基因組提取試劑盒進行提取，操作方法按照說明書進行。PCR反應，以提取的菌株基因組為模板，進行PCR擴增16SrRNA序列，體系為30 μL體系:模板1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，PCR Mix 15 μL，剩下由無菌水補足。反應條件：PCR 條件：95 ℃ 5min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環；72℃ 5 min，4℃結束。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序由上海生工生物工程技術有限公司純化和測序。測序結果在NCBI使用Blast比對，從 GenBank數據庫中獲得與菌株16SrDNA 源的公認標準序列數據，使用Clustal X 1.8將不同的序列對齊后，使用DNAman5.1構建菌株的系統進化樹。

1.3.4 T2-shier-5菌株產酶活性測定 接種過夜培養的環芽孢桿菌T2-shier- 51 mL至100 mL的GAM培養基，37℃，180 r/min過夜培養，取10 mL活化好的菌液，8000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀用無菌水調節OD值至0.5左右（約5×107cfu/mL），接種到滅菌的菜籽粕、豆柏、麩皮、棉籽粕固體發酵培養基中，接種量1 mL/瓶。振蕩混合，使接種菌液與培養基充分接觸。將接種好的培養基至于37℃培養箱靜置培養48 h。然后，取培養好的固體培養物2.5 g，加入pH 6.7磷酸緩沖液 25 mL，200 r/min搖床中振蕩 30 min后，4000 r/min離心5 min，取上清液為粗酶液，測定其中蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶（木聚糖酶）、淀粉酶和幾丁質酶活。纖維素酶活力、粗酶液蛋白酶活力、粗酶液淀粉酶活力和幾丁質酶活力測定參照陸文清等（2003）、張麗萍和徐巖（2002）、劉德海等（2002）、顧真榮等（2001）、張樹政（1984）的方法。

1.3.5 安全性檢測 采用腹腔注射法進行動物試驗，刮取平板上純培養的菌苔，以無菌生理鹽水制成濃度為5.0×109cfu/mL的菌懸液，設置空白組合對照組，每組共10只小鼠。每只健康成年昆明小鼠一次性腹腔注射0.3 mL，連續觀察7 d。記錄觀察期間小鼠中毒表現及死亡情況，如與對照組相比未觀察到受試小鼠有毒性反應及引起死亡，則判定待檢菌株無毒性。

2 結果

2.1 形態學特征 分離菌株T2-shier-5在GAM培養基上生長良好，24 h形成直徑2～4 mm大小的圓形菌落，呈污白色，菌落不透明，表面水分較少且粗糙有褶皺；油鏡觀察結果為革蘭氏陽性，菌體形態為短桿狀，單個、成對或鏈狀排列，芽孢橢圓、柱狀，由于該菌株革蘭氏染色是在GAM固體培養基培養48 h后進行的，可見大多數細菌死亡，但形態依然可見。

2.2 生理生化特征 將表1中的結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中關于芽孢桿菌的描述及其他一些生化特性相對照，該分離株可初步判定為枯草芽孢桿菌。

2.3 16SrRNA序列測定及同源性分析結果 由圖1可見，T2-shier-5菌株的16S rRNA擴增片段長度為1452 bp。16SrRNA基因測序結果已呈送GenBank數據庫中并被收錄，收錄號為：KP696781。用BLAST進行序列比對，結果表明，分離菌株與GenBank中發表的 Bacillus subtilis strain GD1（登錄號HM055597.1）和 Bacillus subtilis strain CCM9 （登錄號HQ536000.1）16SrRNA同源性均達到99.9%。用DNAStar軟件對T2-shier-5菌株基因與GenBank中已公布的序列比對分析，生成系統發生樹。由圖2和圖3可知，T2-shier-5菌株與 Bacillus subtilis strain GD1菌株屬于同一分支，核苷酸同源性最高，達到99.9%，與另一分支的枯草芽孢桿菌WSEKSU304和WSR-KSU310的核苷酸同源性分別為98.7%和99.8%。確定分離菌株為Bacillus subtilis，命名為 Bacillus subtilis T2-shier-5。

表1 T2-shier-5生理生化鑒定結果

圖1 T2-shier-5菌株PCR電泳圖

圖2 T2-shier-5基因系統發生樹

2.4 產酶能力 由表2可知，該分離株具有較強的纖維素降解能力，但產幾丁質酶能力很低。

圖3 T2-shier-5菌株與參考株序列同源性分析

表2 T2-shier-5的產酶活性

2.5 安全性檢測 對腹腔注射的昆明小鼠連續觀察7 d并未觀察到中毒癥狀及死亡情況。剖檢后也未見任何病理變化，未從各臟器培養出該菌。各對照組均正常。試驗結果表明所分離的芽孢桿菌菌株無致病性。

3 討論

本試驗中，先通過傳統方法對分離出來的菌株做菌落形態觀察和生理生化檢測，然后運用16SrDNA核酸序列分析進行菌株鑒定，這樣可以最大程度地保證結果的準確性和客觀性（龍淼等，2009）。試驗中分離出的T2-shier-5菌株的菌落形態和生理生化特性都與標準枯草芽孢桿菌較為一致，并且16SrDNA核酸全序列與枯草芽孢桿菌的同源性最高，達到99%以上，說明T2-shier-5與枯草芽孢桿菌的親緣關系最近，由進化樹看出，T2-shier-5與芽孢桿菌科芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌聚在同一個分支，結合細菌的菌落形態、生理生化特征可將T2-shier-5鑒定為枯草芽孢桿菌。

芽孢桿菌能產生多種酶類，參與動物消化道的酶池，促進動物對營養物的消化吸收。枯草芽抱桿菌具有較強的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同時還具有降解植物飼料中復雜碳水化合物的酶，如果膠酶、葡聚糖酶等（Singh等，2015）。本試驗分離到的T2-shier-5可產生多種酶，有很強的產纖維素酶能力，但產幾丁質酶能力較低，這可能與其生存環境有關。

4 結論

本試驗從健康兔腸道內分離到一株芽孢桿菌，經形態觀察、革蘭氏染色和16SrRNA序列分析，確定其為枯草芽孢桿菌。通過菌株的產酶試驗和安全性試驗得出結論，該分離株具有一定的益生作用。

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