谷氧還蛋白在牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導臍靜脈內皮細胞氧化應激中的作用

申道南 成偉 賈岳 趙蕾 吳亞菲

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院牙周病科（四川大學），成都 610041

牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是其最重要的毒力因子之一[1]。牙齦卟啉單胞菌及其毒性產物能黏附并侵入到血管內壁中，參與心血管疾病的形成和發展[2-3]。氧化應激（oxidative stress，OS）是由于機體組織或細胞內氧自由基生成增加或清除能力降低導致體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基產生過多，氧化和抗氧化系統失衡，引起組織損傷[4]。

在OS引起的損傷中，蛋白質損傷可產生谷胱甘肽化蛋白質結構，是引起細胞凋亡損傷及衰老的啟動因子。谷氧還蛋白（glutaredoxin，Grx）是細胞抗氧化防御體系的重要蛋白，編碼基因為grx1。Grx可以通過特異性催化還原谷胱甘肽化蛋白質結構以保護細胞免受OS的損害[5]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性表達為磷酸化Akt（phosphorylated-Akt，p-Akt），與OS密切相關。在OS誘導內皮細胞損傷過程中，Akt作為一種細胞存活信號被激活[6]，增加一氧化氮生成，維持內皮細胞功能[7]。Akt也是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）下游的效應分子，位于PI3K/Akt通路的中心位置，可以磷酸化多種細胞因子如核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等以抑制凋亡基因的表達。許多外部刺激因素都能夠激活PI3K從而促進p-Akt的表達[8]。

基于以上研究，筆者推測Grx/Akt通路可能在調節血管內皮細胞氧化損傷過程中具有重要作用。本實驗采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（realtime reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）及Western blot方法，研究牙齦卟啉單胞菌LPS誘導臍靜脈內皮EA-hy926細胞氧化損傷時grx1基因和Grx、Akt、p-Akt（308）蛋白表達的變化，探討Grx在OS引發的細胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 儀器設備和主要試劑

高通量聚合酶鏈反應儀（Eppendorf公司，德國），ABI7300型熒光定量分析儀（Bio-Rad公司，美國）。EA-hy926細胞由上海斯信生物科技有限公司提供。LPS采用美國InvivoGen公司的LPS-PG Ultrapure，Akt、p-Akt、Grx蛋白抗體為上海Proteintech公司產品，Grx特異性抑制劑氯化亞硝脲（carmustine，BCNU）為上海邁坤化工有限公司產品。

1.2 細胞培養及實驗分組

將EA-hy926細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在5%CO2、37 ℃條件下常規培養，傳至5～7代時用于實驗。

將細胞分為LPS組和對照組，LPS組用牙齦卟啉單胞菌LPS（1 000 ng·mL-1）刺激細胞4、12、18、24 h，對照組不添加任何刺激，采用real-time RTPCR檢測grx1基因的表達變化。選擇grx1基因表達變化最明顯的時間點，將EA-hy926細胞分為3組（對照組、LPS組和BCNU組），采用Western blot檢測Akt、p-Akt和Grx蛋白的表達變化；其中對照組不添加任何刺激，LPS組采用LPS（1 000 ng·mL-1）刺激細胞，BCNU組先采用BCNU（25 μmol·mL-1）預處理細胞30 min后，再加入LPS（1 000 ng·mL-1）刺激細胞。

1.3 real-time RT-PCR反應

收集細胞并勻漿后加入1 mL TRIzol試劑，室溫靜置5 min；4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min；吸取上層水相，加入異丙醇，混勻；4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃下7 500 r·min-1離心5 min；加入無RNase水RNA溶解沉淀，-80 ℃保存。將RNA逆轉錄成cDNA，-20 ℃保存。PCR反應體系：反應混合液Premix Ex Tap[天根生化科技（北京）有限公司]10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6 μL，總體積19.6 μL。PCR引物由Primer Premier 5.0設計，由日本TaKaRa公司合成，其序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 Western blot檢測

細胞培養后，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，靜止25 min，-20 ℃保存。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳提取蛋白質，BCA法測定蛋白質的質量濃度。實驗步驟：制膠，電泳，轉膜；加入一抗Akt、p-Akt和Grx蛋白抗體（稀釋度1∶1 000），室溫下搖床孵育1 h，使用洗膜緩沖液（Tris buffered saline Tween，TBST）在搖床上漂洗3次，每次10 min；加入二抗，37 ℃下孵育1.5 h，用TBST在室溫下搖床上漂洗3次，每次5 min；然后化學發光、顯影、定影，使用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的相對分子質量和凈光密度值。

1.5 質量控制和統計學分析

所有實驗進行3次，每次實驗設3組復孔，所有操作均由同一人完成。采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，多個樣本的比較采用單因素方差分析，兩個樣本之間的比較采用t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 LPS對EA-hy926細胞grx1基因表達的影響

與對照組比較，LPS刺激4、12、18、24 h后，LPS組grx1基因的相對表達量均有明顯增加（P＜0.05），12 h增加最為明顯，18、24 h時表達量低于12 h（P＜0.05）（圖1）；由此推斷，在LPS刺激下，grx1基因的表達量隨時間的增加而增加，12 h達到最高。

圖1 grx1基因的相對表達量Fig 1 Relative expression of grx1 gene

2.2 LPS對EA-hy926細胞Grx、Akt、p-Akt（308）蛋白表達的影響

在LPS刺激下，grx1基因在12 h時相對表達量最高，在此基礎上進一步研究EA-hy926細胞表達Grx蛋白和Akt的變化。LPS刺激12 h，Grx蛋白的表達量明顯升高，而BCNU組的表達明顯降低（P＜0.05）（圖2），提示LPS可提高Grx蛋白的表達，而Grx抑制劑BCNU可有效抑制Grx蛋白的表達。Akt表達量在3組間的差異無統計學意義（P＞0.05），而p-Akt（308）在LPS刺激組明顯增高，BCNU組明顯降低（P＜0.05）（圖2），可見BCNU也可抑制p-Akt（308）的表達。

圖2 Grx、Akt、p-Akt（308）蛋白的電泳圖譜Fig 2 Protein electrophoresis of Grx, Akt and p-Akt (308)

3 討論

牙周炎與冠心病的發病機制有很大的相似性[9]。在動脈粥樣硬化區和心肌梗死區都能檢測到牙齦卟啉單胞菌的沉積[10]。Gibson等[11]發現，人體血清中的抗牙齦卟啉單胞菌抗體水平與冠心病存在一定的相關性。牙齦卟啉單胞菌的毒力因子LPS可產生炎癥因子如ROS等，從而引發機體內毒素血癥。Cavrini等[12]通過一系列流行病學調查發現，內毒素感染可能是心血管疾病發生的一個危險因素。

Grx是一類小型的氧化還原酶，通過谷胱甘肽發揮生物學效用。Grx體系是抵御OS損傷的重要體系。在正常環境中，細胞體內Grx表達量恒定，當細胞內氧化物和抗氧化物比例失衡，產生超氧化自由基，機體抗OS系統Grx和硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）啟動，Grx消耗量增加。Aesif等[13]發現，LPS可以通過LPS-IκB激酶（IκB kinase-β，IKKβ）-NF-κB-Grx途徑刺激小鼠肺上皮細胞和巨噬細胞grx1基因的表達，提高其表達量。本實驗結果發現，LPS刺激EA-hy926細胞后，grx1基因表達量在刺激初期隨時間的增加而增加，12 h達到最高值。Murata等[14]發現，在OS條件下，grx1基因的初期表達量呈升高趨勢，與本研究結果相同。Western blot檢測結果顯示：Akt蛋白水平的表達無明顯變化，而Grx和p-Akt（308）的變化趨勢基本相同。由此推測，在OS初始階段，細胞內ROS含量增加，機體發生代償反應，Grx增加，調節p-Akt（308）水平上升；加入BCNU預處理后，Grx表達被抑制，p-Akt（308）水平隨之降低，提示p-Akt（308）可能受Grx調節。Wiedermann等[15]報道，通過下調Grx mRNA的表達，減少Grx含量，可以降低Akt的磷酸化水平。由此推測，人體細胞中Grx的高表達在組織早期抗OS過程中有十分重要的作用。在LPS刺激下，Grx通過調控Grx/Akt通路改變Grx表達水平，影響細胞的氧化敏感性，進而調控局部組織免受OS損害。

PI3K/Akt是一條經典的存活信號通路，在細胞凋亡和腫瘤發生中發揮著重要作用。 PI3K是Akt上游信號通路的主要效應物，可使其下游分子Akt磷酸化，上調Akt磷酸化水平，從而抑制細胞凋亡。Kim等[16]發現，LPS刺激肺上皮細胞能增加ROS表達，當抑制PI3K活性之后，ROS生成量升高，Akt磷酸化水平降低。另有研究[17]證實，Grx可以上調Akt的活性受體如PI3K等，也可能是調節Akt磷酸化水平的蛋白之一。此外，Reynaert等[18]發現，Grx在雙氧水刺激下可以調節NF-κB的活性。NF-κB是重要的免疫信號傳遞因子，可以調控細胞增殖、分化以及存活，與細胞凋亡關系密切[19]。活化的Akt既可以通過磷酸化NF-κB的抑制性輔助因子激酶α調節其活性，也可以通過絲裂原活化蛋白3激酶影響IKKβ和NF-κB的活性[20]。細胞內的信息傳遞都是相互作用的，共同協調生命活動。由此推測，在OS條件下，Grx可以影響NF-κB活性，而NF-kB則負反饋調節Grx的表達。

本研究利用牙齦卟啉單胞菌的LPS誘導EA-hy926細胞，結果發現，LPS能在基因水平影響血管內皮細胞grx1基因的表達，Grx蛋白可能通過Grx/Akt這一通路調節p-Akt（308）的表達。Grx既是機體內調節OS反應的重要蛋白，也可能是細胞通過Akt途徑調節細胞凋亡這一通路的關鍵蛋白。該結果在一定程度上揭示了LPS在OS導致的心血管疾病中的作用機制；并提示通過改變Grx表達水平可以改變細胞的氧化敏感性，這為牙周病和心血管疾病等由OS損傷導致的疾病治療提供新的思路。

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