張二飛，羅志鍇，李 瑩，侯立朝，胡 彬(延安大學附屬醫(yī)院麻醉科，延安 76000;第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院麻醉科;通訊作者，E-mail:ydfymzk@6.com)

膿毒癥，是感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，是住院患者最常見的死亡原因之一，死亡率高達20%-30%［1］。在美國住院患者中膿毒癥的患病率是2%，這些病人中有近50%的患者需要在ICU中接收治療［1］。在中國，膿毒癥病人在ICU的死亡率也高達28.7%［2］，膿毒癥的高死亡率、高花費越來越受到人們的重視。有研究表明100%氧對鼠的無菌性腹膜炎［3］和豬的有菌性腹膜炎［4］均有治療作用，而且在ICU接受治療的患者吸入100%氧也常常被用作支持治療。人們普遍認為，當機體不能限制局部性的感染而使其發(fā)展為全身性感染，就激活全身性的炎性反應(yīng)，進一步造成組織損傷［5］。所以膿毒癥中機體清除細菌的能力對其預(yù)后非常重要。近來研究表明NO(nitric oxide)是個有效的殺菌分子［6，7］。盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)誘導的膿毒癥模型被認為是經(jīng)典的、模擬臨床特征的動物模型［8，9］。因此本實驗探索100%氧對盲腸結(jié)扎穿孔誘導的膿毒癥的改善作用及是否通過NO介導的細菌清除機制，以期為臨床治療膿毒癥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

動物:遵循第四軍醫(yī)大學實驗動物管理和使用委員會批準的所有的動物協(xié)議。雄性C57BL/6小鼠(20-25 g)由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心獲得。實驗操作1周前，領(lǐng)取動物適應(yīng)實驗室的環(huán)境，保持室溫(20-25℃)，用12 h光照-黑暗周期，并自由獲取食物和水。一氧化氮檢測試劑盒，一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)(NG-nitro L-arginine methylester)均為碧云天生物技術(shù)研究所(江蘇省，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和模型制作 按照完全隨機的方法將C57BL/6小鼠分為4組:假手術(shù)+空氣組，假手術(shù)+100%氧組，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+空氣組，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) +100%氧組。雄性 C57BL/6小鼠(20-25 g)水合氯醛麻醉后，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模型(膿毒癥模型)具體制備步驟:小鼠下腹部備皮和消毒，縱向中線皮膚切口(約2 cm)，暴露盲腸，在遠極和盲腸的基部之間50%的距離無菌線結(jié)扎盲腸，結(jié)扎處遠端用21號針頭穿刺盲腸，穿刺孔處擠出少量的糞便物質(zhì)，然后原位放回盲腸，造成較重的膿毒癥模型，存活率大約在30%左右。假手術(shù)模型制備:同樣備皮、消毒、打開腹腔，然后，間斷縫合腹壁兩層，關(guān)閉腹腔。術(shù)畢，將小鼠放置于暖箱復(fù)蘇，蘇醒后放回恒溫的動物房自由飲水進食。

1.2.2 100%氧治療和生存率觀察 治療組:假手術(shù)+100%氧組和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+100%氧組在假手術(shù)或盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后6 h，小鼠被放置在密封的有機玻璃室中。氧氣通過一個軟管輸送到玻璃室中。密室的另一端連接氣體分析儀(多功能氣體分析儀，丹麥)連續(xù)監(jiān)測，隨時調(diào)節(jié)氧氣流量使得治療過程中氧濃度達95%-100%的預(yù)定水平，CO2由放置在密室中的吸收劑吸收，100%氧持續(xù)干預(yù)2 h，房間和密室的溫度保持在20-22℃。對照組:假手術(shù)+空氣組和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+空氣組，動物術(shù)中或蘇醒后自由呼吸空氣。所有的動物蘇醒后，于鼠籠中放置于恒溫的動物室，進行7 d的生存率觀察(每組n=20)。

1.2.3 細菌計數(shù) 術(shù)后24 h，小鼠麻醉后，消毒下腹部，在原切口旁切開腹腔，注射無菌的生理鹽水1 ml，輕輕搖晃腹腔1 min后，取腹腔液4 μl在冰上用無菌生理鹽水連續(xù)稀釋，然后于瓊脂培養(yǎng)基中37℃溫箱孵育，24 h后進行菌落數(shù)計數(shù)(每組n=6)。

1.2.4 NO檢測 小鼠腹膜腔用2 ml的無菌生理鹽水灌洗，小心地吸出，大約1 ml可獲得，然后以400×g，5 min離心，分裝，測定。NO的檢測根據(jù)試劑盒的說明進行操作(每組n=6)。

1.2.5 NO合酶抑制劑的處理 按照完全隨機的方法將C57BL/6小鼠分為5組:假手術(shù)+生理鹽水+空氣組，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+空氣組，盲腸結(jié)扎穿孔+L-NAME+空氣組和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+100%氧組，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) +LNAME+100%氧組。治療組:盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+LNAME+100%氧組，盲腸結(jié)扎穿孔+L-NAME+空氣組，在手術(shù)后2 h給予腹腔注射L-NAME(20 mg/kg);對照組:假手術(shù)+生理鹽水+空氣組，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+100%氧組和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+空氣組，在手術(shù)后2 h給予等體積的無菌生理鹽水(每組n=6)。

2 結(jié)果

2.1 100%氧對膿毒癥鼠的生存率影響

與假手術(shù)后吸入空氣比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后吸入空氣明顯導致小鼠死亡(P＜0.001，圖1);與盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后吸入空氣組比較，盲腸結(jié)扎穿孔后6 h吸入100%氧2 h明顯提高了膿毒癥鼠的生存率(P＜0.05);假手術(shù)后吸入100%氧無死亡與假手術(shù)+空氣組生存率相同(見圖1)。

圖1 100%氧對膿毒癥鼠的生存率影響(n=20)Figure 1 Effect of 100%oxygen on survival rate of septic mice(n=20)

2.2 100%氧對膿毒癥鼠的細菌清除的影響

與假手術(shù)后吸入空氣組比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后吸入空氣組腹腔灌洗液中明顯培養(yǎng)出大量細菌(P＜0.001，見圖2);與盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后吸入空氣組比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后6 h吸入100%氧2 h明顯增強了膿毒癥鼠的細菌清除(P＜0.001，見圖2);假手術(shù)后吸入100%氧組腹腔灌洗液中同假手術(shù)后吸入空氣組一樣沒有培養(yǎng)出細菌。

2.3 100%氧對膿毒癥鼠腹腔灌洗液中NO含量的影響

與假手術(shù)后吸入空氣組比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后吸入空氣組明顯增加了腹腔灌洗液中NO的含量(P＜0.01，見圖3);與盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后吸入空氣組比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后6 h吸入100%氧2 h進一步增加了膿毒癥鼠腹腔灌洗液中NO的含量(P＜0.01，見圖3);假手術(shù)后吸入100%氧組腹腔灌洗液中NO的含量同假手術(shù)后吸入空氣組比較無統(tǒng)計學差異。

2.4 L-NAME對100%氧增強膿毒癥鼠的細菌清除力的影響

與盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+空氣組比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+100%氧組腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)計數(shù)明顯減少(P＜0.001，見圖4);與盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+生理鹽水+100%氧組比較，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)+L-NAME+100%氧組腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)計數(shù)明顯增加(P＜0.01，見圖4);盲腸+生理鹽水+空氣組腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)計數(shù)無統(tǒng)計學差異。

圖2 100%氧對膿毒癥鼠的細菌清除的影響(n=6)Figure 2 Effect of 100%oxygen on bacterial clearance of septic mice(n=6)

圖3 NO在腹腔灌洗液中的產(chǎn)量(n=6)Figure 3 NO production in peritoneal lavage fluids of sepsis mice(n=6)

圖4 L-NAME對100%氧增強膿毒癥鼠的細菌清除力的影響(n=6)Figure 4 The influence of L-NAME on 100%oxygen for bacterial clearance in septic mice(n=6)

3 討論

膿毒癥是一個綜合征，不是一個疾病［10］，是微生物感染引發(fā)的一系列臨床綜合征，若機體不能限制感染于局部，就會引發(fā)全身的炎性反應(yīng)，進一步促使組織器官損傷［5］。許多研究都在致力于尋找改善膿毒癥的臨床策略，但臨床結(jié)果卻并不理想［11］。100%氧在臨床中是我們經(jīng)常使用的，有研究表明100%氧對無菌性和有菌性腹膜炎的動物是有益的［3，4］，而且也有研究表明高壓氧對失血性休克復(fù)蘇后的6 h生存率有益［12］。嚴重的膿毒癥常常表現(xiàn)為膿毒性休克［1，13］，需要接受 ICU 的治療，在 ICU中目前吸入純氧是最為常見的支持治療之一，但是長期的氧吸入又帶來氧中毒的并發(fā)癥［14］。但合理的吸入策略是有益的，本小組的前期研究表明兩次持續(xù)吸入100%氧2-3 h對酵母多糖誘導的腹膜炎有改善作用［3］，而且本實驗在經(jīng)典的膿毒癥模型CLP(盲腸結(jié)扎穿孔)［8］中，手術(shù)后 6 h持續(xù)吸入100%氧2 h，膿毒癥小鼠的生存率從30%提高到70%，同樣我們并未發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組術(shù)后6 h吸入100%氧2 h對小鼠有致死性或危害。

細菌的入侵是膿毒癥的重要病理生理，機體對病原微生物的清除和防御是疾病發(fā)展轉(zhuǎn)歸的重要因素［5］。本實驗發(fā)現(xiàn)100%氧吸入明顯增強了膿毒癥小鼠的細菌清除能力，這表明100%氧改善膿毒癥小鼠的生存率是與提高機體細菌清除能力有關(guān)系的。目前研究表明NO是種有效的殺菌分子［6，7］，增加NO的產(chǎn)量明顯改善了小鼠的膿毒癥及膿毒癥誘導的肺損傷［7，15］，也有研究表明補充 NO 的前體精氨酸可以改善膿毒癥鼠的致死率［16］。本研究發(fā)現(xiàn)100%氧可以增加CLP誘導的膿毒癥鼠術(shù)后24 h腹腔灌洗液中NO的含量。NO在細胞中通過NO合成酶以L-精氨酸和分子氧作為底物反應(yīng)生成的［17］。為了進一步驗證100%氧增加膿毒癥鼠NO的含量與細菌清除有關(guān)，根據(jù)文獻報道［6］，我們在術(shù)后2 h腹腔注射NO合酶抑制劑(L-NAME)，阻斷NO的產(chǎn)生，24 h后取腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)計數(shù)，結(jié)果表明:L-NAME顯著逆轉(zhuǎn)了100%氧增強細菌清除的能力。這些結(jié)果表明100%氧在CLP誘導的膿毒癥后6 h吸入2 h可以明顯提高膿毒癥鼠的生存率，該保護效應(yīng)是通過100%氧增加膿毒癥鼠腹腔中NO產(chǎn)量介導的細菌清除。也有研究表明膿毒癥中大量NO的產(chǎn)生增加了組織的損傷和心臟功能的抑制，但這備受爭議［18］。也許適當?shù)腘O產(chǎn)生對膿毒癥是有益的，具體的機制不清楚，還有待于后期的進一步研究。

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