黑曲霉β-葡萄糖苷酶對葡萄酒酶解增香調控及香氣物質的影響*

桑葦，唐柯，徐巖，王棟，李記明

1(工業生物技術教育部重點實驗室、江南大學生物工程學院釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇無錫，214122)

2(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東煙臺，264000)

香氣是葡萄酒的重要感官指標，對葡萄酒的風格和品質有重要的影響［1］。葡萄酒香氣根據來源不同分為品種香、發酵香和陳釀香［2］。葡萄酒中的香氣成分主要以游離態和結合態香氣前體物質的形式存在，結合態物質本身沒有香氣，必須經過分解釋放才能產生香氣。通常葡萄漿果中以葡萄糖苷鍵形式存在的結合態香氣物質的含量比游離態的呈香物質要豐富，如單萜烯基-β-葡萄糖苷、以S-半胱氨酸形式存在的硫醇等，這些風味前體物質的含量遠多于揮發性的萜烯化合物［3-4］。由于結合態香氣物質本身沒有香氣且不揮發或難揮發［5］，為使這些香氣分子釋放，就需要打斷結合香氣分子的糖苷鍵，從而釋放出具有濃郁香氣且易揮發的糖苷配基。糖苷配基主要包括萜烯類化合物、脂肪醇類、芳香烴類衍生物等，β-葡萄糖苷酶則是這些香氣分子釋放過程酶系中最重要的酶之一［6-8］。

β-葡萄糖苷酶是芳香前體水解、結合態糖苷配基釋放的關鍵酶［9］。1837年Liebig 和 W?hler［10］在苦杏仁汁中首次發現了β-葡萄糖苷酶。González Pombo［11］、Pardo García［12］等用 β-葡萄糖苷酶水解酶系處理麝香(Muscat)葡萄酒，GC-MS分析結果表明，經酶處理后葡萄酒的香氣成分芳樟醇、香葉醇、α-松油醇、芳樟醇氧化物等含量明顯提高。Baffi［13］等人篩選出產自出芽短梗霉的β-葡萄糖苷酶，對葡萄酒加酶處理后單萜類物質含量亦有顯著提升。郭慧女［14］等研究了黑曲霉β-葡萄糖苷酶對麝香葡萄酒中結合態香氣提取物質的酶解作用效果，水解斷裂產生典型的萜烯、醇類、酯類等化合物，釋放出令人愉快的香氣物質。

β-葡萄糖苷酶是風味修飾中的關鍵酶，對葡萄酒香氣的提升具有十分重要的作用，但由于我國葡萄酒工業起步較晚，目前葡萄酒用商業酶制劑基本都為國外所壟斷。本課題組在前期研究中從葡萄園環境中篩選得到1株高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉(Aspergillus niger)，且酶具有較好的應用特性［14］。本研究則利用這株黑曲霉產β-葡萄糖苷酶，采用Kramer感官評定的方法研究β-葡萄糖苷酶對赤霞珠葡萄新酒酶解增香調控的最佳條件，并采用固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用(SPME-GC-MS)分析酶解處理對葡萄酒香氣物質的影響，旨在為風味酶的國產化應用以及葡萄酒的工業化酶解增香提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠干紅葡萄酒，2013年產，張裕葡萄釀酒股份有限公司;黑曲霉產β-葡萄糖苷酶，電泳純級別;無水NaCl，分析純，上海國藥集團;內標物2-辛醇(2-Octanol)，色譜純，Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜質譜聯用儀GC 6890N-MSD 5975，美國Agilent公司;DB-FFTP色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國J＆W公司;Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄酒酶解反應實驗

經單因素酶解實驗，選擇合適的酶解溫度、酶解時間及加酶量3個因素，設計L9(34)正交實驗［15］，實驗設計如表1、表2所示。

表1 正交實驗設計Table 1 Orthogonal test

表2 正交實驗樣品編號Table 2 Sample number of the orthogonal test

1.3.2 Kramer感官順位評定

15名經過1年以上感官品評培訓的品評員，在室內溫度適宜，陽光充足條件下，對已隨機編號的正交實驗酶解處理的9個樣品及空白對照樣品(J)進行聞香，并按照香氣濃度強弱程度進行打分排序。

利用SPSS Statistics 19.0軟件Duncan多重比較方法處理Kramer感官品評數據［16］，得到實驗條件下β-葡萄糖苷酶對葡萄酒酶解增香調控的最佳條件。

1.3.3 HS-SPME分析條件

在最佳條件酶解反應后，樣品待HS-SPME分析。

頂空固相微萃取條件:45℃預熱2.5 min，萃取吸附45 min，GC解析5 min，用于GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS 分析條件［17］

GC條件:樣品經DB-FFTP色譜柱分離;進樣口溫度250℃，不分流;載氣為He，流速2 mL/min;柱溫升溫程序:初始溫度50℃，穩定2 min后，以4℃/min速率升溫至230℃，保持15 min。分離后的樣品經過MSD5975檢測。

MS條件:EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為230℃，掃描范圍30.00～500.00 amu。每個樣品重復測定3次求取平均值。

1.3.5 物質定性與半定量方法

物質定性:香氣活性成分的定性通過與NIST 05質譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標準譜圖進行檢索比對，并根據改進的Kovats［18］法計算得到各物質保留指數(RI)進行確認。

組分峰面積的相對含量:在待測酒樣中加入2-辛醇(2-Octanol)內標，進GC-MS分離。計算公式為:

其中Xi為待測物質相對含量;Cs為內標物質濃度;Ai為待測物質峰面積;As為內標物質峰面積。

2 結果與分析

2.1 Kramer感官順位評定結果及分析

酒樣按照正交設計實驗中的條件處理結束后，進行Kramer感官品評。在進行感官品評時，品評員得到隨機排序編號的樣品后，按照香氣強弱程度將樣品先大致分為強、中、弱3組，再在3組組內進行比較排序，確定所有樣品香氣強弱順序，最終所有樣品按照香氣由弱到強進行排列。對于不同樣品，如無法區別時，在評價時注明相同位級。

15名感官品評員對10個葡萄酒樣品的香氣強弱程度進行Kramer感官評定，結果如表3所示。由表3中看出，15名品評員對10個葡萄酒樣品進行較好排序，無相同位級。

表3 Kramer感官順位評定結果(香氣由弱到強)排序Table 3 Kramer sensory evaluation result(weak to strong)

利用SPSS Statistics 19.0軟件Duncan多重比較方法處理Kramer感官品評數據，得到表4。依據品評員數 n=15，樣品數 m=10，查表［19］，得到顯著性水平臨界值。α=0.01顯著水平:上段為49～116，下段為57～108。由表4中 Rmax=RE=123＞116，Rmin=RJ=41＜49，15名品評員排序有效，在P=0.01具有顯著性差異。10個樣品依顯著性劃分為3組:樣品A、J樣品為一組，樣品 B、C、D、F、H、I為一組，樣品E、G為一組，且組內無顯著差異。

表4 10個葡萄酒樣品位級及位級和Table 4 Rank and rank sum of ten samples

2.2 酶解增香最佳條件的確定

根據Kramer感官順位評定得到樣品的位級和，對赤霞珠葡萄酒酶解增香的正交實驗結果進行極差分析，結果如表5所示。

表5 正交實驗極差分析Table 5 Experiment result of orthogonal design and range analysis

比較表5中的極差差異，可知影響葡萄酒酶解增香3個因素的主次順序為酶解溫度、加酶量、酶解時間。其中酶解溫度為主要影響因素，可見酶的活性與作用環境溫度相關性較大，加酶量次之。綜合正交實驗極差分析結果，可得3個實驗因素的最優組合為A2B2C3，即在酶解溫度45℃、酶解時間4.0 h、加酶量4.0 U/mL條件下處理的葡萄酒。

2.3 酶解處理對赤霞珠干紅葡萄酒香氣物質的影響

依據酶解增香調控的優化條件實驗結果，處理赤霞珠干紅葡萄酒，研究酶解處理對赤霞珠葡萄新酒香氣物質的影響。對酶解前后樣品中的揮發性物質進行定性及組分峰面積的相對含量比較，數據進行單因素方差分析，結果如表6所示。

對添加黑曲霉β-葡萄糖苷酶實驗前后的酒樣經GC-MS檢測分析，共定性得到59種呈香物質。單因素方差分析結果表明，共35種物質在處理前后具有顯著性差異(P＜0.05)，其中23種物質具有極顯著差異(P＜0.01)。酶解處理后香氣物質相對總量與對照相比增加24.59%，其中萜烯及C13-降異戊二烯類物質相對含量增加118.54%，醇類物質相對含量增加19.12%，芳香族類化合物相對含量增加17.24%，酯類物質相對含量增加16.04%，這4類物質相對含量占總含量的94.64%。

在所有香氣物質中，萜烯及C13-降異戊二烯類物質相對含量增加最為明顯突出，且都具有顯著性差異。萜烯及C13-降異戊二烯類物質是形成和決定葡萄酒品種香氣關鍵的因素，通常都具有濃郁的香氣及較低的感官閾值［20］，是釀酒葡萄原料中潛在的非常重要的香氣成分，對葡萄酒品質起著舉足輕重的作用［21］。萜烯類化合物多以無味的糖苷態形式存在，通過外源添加糖苷酶則是釋放游離態萜烯化合物的有效方法。從表6可以看出，經酶解后的葡萄酒樣品，萜烯類物質相對含量均有明顯提升。含量增加最多的是4-萜品醇，其相對含量增加682%，可以釋放松節油、核仁等香氣;其次是α-松油醇，其相對含量增加239%，具有茴香，薄荷的香氣特征;香葉醇相對含量增加205%，能夠釋放玫瑰花、天竺葵香氣;香葉基丙酮相對含量增加150%，具有木蘭花香;β-紫羅蘭酮相對含量增加113%，表現出紫羅蘭花香的香氣特征;香葉醛相對含量增加51%，具有薄荷，檸檬等香氣;β-大馬酮相對含量增加43%，能夠釋放濃郁的蜂蜜香氣。本實驗與Baffi［13］研究來源于出芽短梗霉的β-葡萄糖苷酶作用結果相比，更多地釋放了4-萜品醇、β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等香氣物質。萜烯類香氣的釋放，也使葡萄酒品種香更加馥郁豐富。

由以上結果可知，來源于黑曲霉β-葡萄糖苷酶對結合態萜烯類物質具有很強的作用效果，有效地水解結合態前體物質糖苷鍵，促使糖苷配基及香氣小分子的釋放，對提高葡萄酒中典型性香氣，建立葡萄酒獨特風格起到積極影響。

表6 糖苷酶處理前后對比結果及顯著性分析Table 6 One-way analysis of variance of aroma compounds content before and after β-glucosidase processing

續表6

3 結論

本研究采用黑曲霉β-葡萄糖苷酶，研究其對葡萄酒增香調控最佳條件及酶解對香氣物質的影響。采用Kramer感官品評的方法，確定了β-葡萄糖苷酶酶解增香調控的最佳條件為酶解溫度45℃、酶解時間4.0 h、加酶量4.0 U/mL。對添加黑曲霉 β-葡萄糖苷酶實驗前后的酒樣經GC-MS檢測分析，共定性得到59種呈香物質。方差分析結果表明有35種物質在處理前后具有顯著差異(P＜0.05)，其中23種物質具有極顯著差異(P＜0.01)。β-葡萄糖苷酶對結合態萜烯類物質具有良好的水解作用，這些物質含量的增加對葡萄酒風味改變都起到積極作用和影響。

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