含AOZ蝦糜自然材料的實驗室內快速獲取方法*

余孔捷，林永輝，劉正才，黃杰，陳旭東，王丹紅，盧聲宇

(福建出入境檢驗檢疫局，福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州，350001)

硝基呋喃類藥物及其代謝物具有很大的毒性和副作用，能誘導有機體基因突變，有致畸胎，誘發癌癥風險［1］，我國及歐盟等國家和地區禁用硝基呋喃類藥物于食用動物，要求在動物源性食品中不得檢出該類殘留物［2-3］。在動物體內，硝基呋喃類藥物代謝快，但其代謝物則會存留較長時間，因而代謝物作為該類藥物的標記殘留物。硝基呋喃類藥物殘留是我國出口水產品等較高頻次檢測項目之一，也是國內重點監控的指標。為保證水產品中藥物殘留檢測的工作質量，需要含目標殘留物自然基體質控標樣。文中涉及的AOZ是硝基呋喃類藥物之一的呋喃唑酮的代謝物(3-氨基-2-唑酮)。理想的的質控樣應是外觀狀態(如非凍干粉)和內在結合狀態(如均為體內代謝自然結合)都與實際檢測樣品一致的自然基體樣品，以保證二者在分析中的操作步驟和提取效率都能一致［4］。余孔捷等曾報道在野外養殖池中藥浴方法獲得陽性材料制備含AOZ蝦肉糜自然基體標準樣品(RM)［5］，但涉及野外作業成本高耗時長多有不便。本文在其基礎上建立了實驗室內藥浴活蝦快速獲取合適含量水平的自然基體陽性材料方法，并制備了多含量水平自然基體質控樣品用于主持實施國家認監委(CNCA)的“水產品中呋喃唑酮代謝物(AOZ)檢測能力驗證”計劃項目。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

南美白對蝦(Penaeusvanammi)，采用市售活蝦，每500g約55尾，經LC-MSMS檢測無AOZ殘留;市售醫用呋喃唑酮片，經HPLC檢測呋喃唑酮含量為6%;藥浴用水為自來水。

攪拌型勻漿機，丹麥FOSS 2094型;拍擊均質器，Stomacher 3500型，英國 Seward;真空包裝機，SC-300A型，安溪縣三和茶葉機械廠;Co60-γ射線輻照裝置，設計容量1.85×1016Bq，福建省康普頓輻照技術有限公司;冰柜，BC/BD-718A，青島海爾特種電冰柜有限公司;藥浴實驗用空氣泵，漁亭牌ACO-002型，浙江森森實業有限公司;藥浴實驗池，市售塑料方桶，下部外徑約67 cm×46 cm，高61 cm。

1.2 活蝦藥浴

準備好潔凈的B、C 2個藥浴實驗池(空桶)，加注自來水約40 cm深。分別稱取研成粉末的含量為6%的呋喃唑酮藥末28 mg和46 mg各1份，各加水約100 mL，混勻，分別轉移至B、C池中，攪勻。此時，池中藥浴液含呋喃唑酮初始濃度分別約為B池13.6 ng/L、C池22.4 ng/L。各5 kg無呋喃唑酮污染活蝦直接轉移B、C池中，并開始計時。藥浴時，用空氣泵接乳膠管不間斷向藥浴液中增氧。放置藥浴池的室內有空調調節室內基本保持20℃。藥浴5 h后，撈起藥蝦(記為B蝦、C蝦)。

1.3 藥蝦及陽性材料的處理

B蝦、C蝦分別按下述步驟處理:經冷凍處死后去頭剝殼取肉，-20℃冷凍保存。將冷凍狀態蝦肉樣本轉移至4℃冰箱解凍后置于勻漿機中，充分勻漿。混合所有樣漿。然后，取適量裝入拍擊袋后置于拍擊式均質器中，按180拍/min的頻率，每次拍擊2 min后取下揉混袋中漿樣，再拍擊，如此反復拍擊3次。拍擊后漿樣混合于大桶中，再次人工混勻。取糜樣每份約25 g裝入PE膜內袋，再套上PA/CPP耐蒸煮復合膜外袋。用真空封口機對裝好糜樣的外袋熱封口。貼上帶編號的樣品標簽。將裝袋、封口、上簽的樣品送福建省康普頓輻照技術有限公司進行輻照滅菌，輻照劑量為12 kGy。滅菌后樣本置于-20℃冰箱中貯存。

1.4 均勻性、穩定性檢驗

各濃度水平樣品分別隨機抽取10份，每個樣品重復條件下測定2次。采用單因子方差分析法(F檢驗法)對檢驗結果進行統計處理。

進行了6個時間節點的共6次穩定性檢驗，日期分別為5月11日、5月26日、5月28日、6月15日、7月18日、8月5日。在這些日期隨機抽取B、C 2個水平樣品各6份。檢測方法、檢測人員、儀器、實驗室與均勻性檢測相同。采用t檢驗法評定樣品穩定性。

1.5 實施全國能力驗證后獲得的中位值

用上述獲得的樣品成功實施國家認監委的全國性實驗室檢測能力驗證［6］，B樣、C樣各有34家檢測實驗室參加，中位值分別為 4.20、6.74 μg/kg。

2 結果與討論

2.1 藥浴時間的選擇及藥浴與預實驗

根據野外蝦池藥浴實驗結果(參考文獻［5］之圖1)，藥浴后蝦體內AOZ含量變化相對平穩的有峰值前后、藥后9～24 h和30 h后3個時間段，這3個時間段較適宜撈蝦，以減少個體間含量差異。考慮到盡量節省藥浴時間，也由于在室內條件下高密度藥浴不宜長時間進行，以減少活蝦死亡率，本文室內藥浴實驗選擇了峰值附近的5h結束藥浴并撈蝦。

相同藥浴時間不同的藥浴液初始濃度的藥后蝦體應有不同的AOZ含量，為了解本實驗條件下藥后蝦體中AOZ含量與藥浴液初始濃度(x)的關系，采用藥浴液初始濃度(35.6 ng/L，單濃度水平)進行了預實驗，預實驗所得蝦糜AOZ含量(y)經檢測為13.5 μg/kg。則在本實驗條件下有y=0.38x。根據經驗假設輻照滅菌后AOZ含量(yi)約有15%的損失率，即輻照后AOZ含量yi=0.85y，則yi=0.32x。

2.2 獲取陽性材料的藥浴

按yi=0.32x估測藥浴液初始濃度x。期望獲得4.4、7.2 μg/kg 的 yi，選擇藥浴液初始濃度 x 分別為為13.6 ng/L(xB)和22.4 ng/L(xC)。藥浴后所得藥蝦AOZ含量檢測結果分別為B蝦4.61 μg/kg、C蝦7.05 μg/kg。與預期值差別不大。而輻照滅菌效果和考察阻隔性包裝效果在參考文獻［6］中已得驗證，此不贅述。

2.3 均勻性穩定性檢驗結果

均勻性檢驗統計結果見表1。查臨界值F0.05(9，10)=3.02。表2計算各樣品的F值均小于臨界值，表明在0.05顯著性水平時，樣品間和樣品內無顯著性差異。

表1 均勻性檢驗統計結果Table 1 The statistical results of homogeneity test

穩定性檢驗統計結果見表2。表2中參考值系均勻性檢驗數據。查t雙尾臨界=2.14，表3計算所得t值均小于t雙尾臨界值。表明樣品是穩定的。

表2 穩定性檢驗統計結果Table 2 The statistical results of stability test

2.4 實施全國能力驗證后獲得的中位值

應用所得陽性樣品成功實施了全國性實驗室能力驗證，該能力驗證共提供A、B、C 3個含量水平的測試樣，其中B、C 2個含量水平樣品即本文所得B樣、C樣(A樣則系本實驗室原有留存質控樣，每個參加實驗室檢測其中兩個水平樣品)。檢測B樣、C樣的實驗室各有34家，經結果統計B樣、C樣中位值分別為4.20、6.74μg/kg。比較中位值與預期值，B樣、C樣的相對相差分別為-4.5%和-6.4%，均可接受。B樣、C樣的實驗室結果相關統計參數見表3。B樣、C樣品中位值作為指定值，實施了參加能力驗證結果可疑和離群實驗室的后續補測(測量審核)活動。4家實驗室參加B樣補測，9家實驗室參加C樣補測，結果除B樣結果可疑外，其他結果均滿意。

表3 實驗室結果的統計匯總Table 3 Statistical parameters of laboratory test result

3 結論

本文建立的實驗室內快速獲取含AOZ蝦糜自然基體陽性材料的方法，無需野外作業，簡便省時。經用于實施全國性能力驗證實踐，所制質控樣品均勻穩定，同時保證了外觀狀態(非凍干粉)和內在結合狀態(體內代謝自然結合)都與日常檢測樣品一致，以免導致二者在分析中的操作步驟和提取效率的可能不一致。

［1］ 彭濤，儲小剛，楊強，等.高效液相色譜/串聯質譜法測定奶粉中的硝基呋喃代謝物［J］.分析化學，2005，33(8):1073-1076.

［2］ Comission Regulation(EC)No1442/95.of 26 June 1995 amending AnnexesⅠ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ of Council Regulation(EEC)No 2377/90 laying down a community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin［S］.

［3］ 農業部193號公告-2002.食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單［S］.

［4］ Gowik P，Polzer J，Uhlig S.Reference material in residue control:assessment of matrix effects［J］.Accreditation and Quality Assurance，2007，12(3/4):161-166.

［5］ 余孔捷，劉正才，楊方，等.AOZ殘留分析質控用蝦糜自然(污染)基體標準樣品的研制［J］.分析試驗室，2010，29(3):50.