弱化乙醇途徑關鍵酶活性減少釀酒酵母在丙酮酸發酵過程中副產物乙醇的積累*

吳滿珍，李鵬越，蘇珂，徐國強，蔣伶活

1(江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學生物工程學院，江蘇無錫，214122)

作為TCA循環的中間產物，蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸等C4二元羧酸廣泛應用于食品、醫藥和化工等產業。鑒于C4二元羧酸重要的應用價值及潛在的應用前景，2004年，美國能源部專門成立了C4二元羧酸研究組研究這些有機酸的生產工藝和應用［1］。微生物發酵法生產C4二元羧酸因具有原料可再生、生產工藝對環境污染小等優勢而備受關注［2-5］。釀酒酵母具有:(1)營養需求簡單，下游分離工藝成本低廉;(2)能耐受較低pH條件及高濃度底物產生的滲透壓;(3)長期用于食品和釀造等領域，并通過FDA認證，發酵產品具有安全性;(4)遺傳信息豐富，代謝改造操作簡便［6］。因此，這種微生物被認為是生產C4二元羧酸的潛在最適微生物。

在高糖濃度及有氧條件下，釀酒酵母會產生大量的乙醇，這種現象被稱為反巴斯德效應(也稱為克勒勃屈利效應)［7］。然而，對于以C4二元羧酸目標產物來說，乙醇的大量產生會導致碳代謝流和輔助因子的損失。因此，如何減少乙醇或消除乙醇的產生，成為釀酒酵母生產C4二元羧酸等羧酸所面臨的共同難題［8］。釀酒酵母乙醇合成途徑主要涉及到丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，Pdc)和乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，Adh)，Pdc 主要有 PDC1，PDC5，PDC6 三個基因編碼，Adh由 ADH1，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6 等基因編碼，其中，ADH1編碼的產物的作用是將乙醛轉化為乙醇［9］。圍繞上述兩個關鍵酶及其輔因子，減少或消除乙醇形成的主要策略及進展如下:(1)缺失丙酮酸脫羧酶，通過同時敲除PDC1，PDC5，PDC6三個基因，完全阻止了乙醇的產生，但菌株不能以葡萄糖為唯一碳源進行分批發酵［10-11］;(2)缺失乙醇脫氫酶，通過同時敲除ADH1，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6 同樣可以完全阻止乙醇的產生，但這種策略會引起甘油和乙醛的積累，從而導致菌體生長較弱［12-13］;(3)調控輔因子水平，硫胺酸是Pdc的輔因子，而THI2和THI3是硫胺素合成途徑的調控基因，敲除THI2或THI3均降低了Pdc的酶活，進而減少了乙醇的生成［14］，但硫胺酸也是α-酮戊二酸脫氫酶的輔因子，因此，敲除THI2或THI3不利于通過氧化TCA途徑積累C4二元羧酸。此外，Tokuhiro等用來源于牛的乳酸脫氫酶基因L-ldh分別替換PDC1和ADH1兩個基因，既實現了同時弱化Pdc和Adh的活性，又實現了外源乳酸脫氫酶在釀酒酵母中的表達，獲得的工程菌株乙醇產量大幅下降，乳酸產量大幅上升［15］。而通過單純敲除PDC1和ADH1兩個基因來同時弱化Pdc和Adh的活性，進而減少乙醇形成未見報道。

鑒于此，本研究嘗試通過敲除PDC1和ADH1兩個基因來同時弱化Pdc和Adh的活性，實現減少乙醇形成的目的。在此基礎上，通過發酵優化提高雙基因缺失突變株的生長特性，以期實現減少乙醇的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C、敲除模板質粒pUG27、標記回收質粒pSH47及PCR引物相關信息見表1。

表1 本研究所用的菌株、質粒、引物Table 1 Lists of S.cerevisiae strains，plasmids and primers used in this study

1.1.2 培養基

YPD培養基(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20(固體培養基加入瓊脂粉20)，pH自然，121℃滅菌20 min。

SD-HIS培養基(g/L):酵母氮源 1.7，(NH4)2SO45，葡萄糖 20，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸0.1，尿嘧啶0.02(固體培養基加入瓊脂粉20)，pH自然，121℃滅菌 20 min。

SD-URA培養基(g/L):酵母氮源 1.7，(NH4)2SO45，葡萄糖 20，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸0.1，組氨酸0.02(固體培養基加入瓊脂粉20)，pH自然，121℃滅菌 20 min。

種子培養基(g/L):葡萄糖 40，YNB 3.4，(NH4)2SO45，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸 0.1，組氨酸0.02，尿嘧啶0.02。裝液量20 mL/100 mL。115℃滅菌20 min。

發酵培養基(g/L):葡萄糖 40，YNB 3.4，(NH4)2SO45，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸 0.1，組氨酸0.02，尿嘧啶0.02。添加CaCO35 g/L，裝液量為40 mL/250 mL。CaCO3單獨滅菌后加入。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法［16］

從-80℃菌種保藏管取菌在YPD(含營養標記質粒的轉化子在對應的SD缺陷培養基)平板上進行劃線活化，30℃培養箱培養48 h;挑取活化的單菌落接種到種子培養基中，30℃、220 r/min搖床培養24 h至飽和;測定每個菌株的OD600值，以起始OD=0.2轉接入發酵培養基中，30℃、220 r/min搖床培養發酵96 h。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量測定

取不同時間點的發酵液 0.1 mL，用 0.4 mol/L的鹽酸除掉發酵液中的碳酸鈣，并稀釋適當的倍數，振蕩混勻。待溶液澄清后，以稀鹽酸為空白，在600 nm波長處測定吸光值，以測得的OD值作為菌體生物量計量單位。

1.2.2.2 代謝物分析

HPLC檢測代謝物:HPLC儀器為Waters 1515，葡萄糖、乙醇用RID檢測器，丙酮酸用紫外檢測器。色譜柱為Aminex HPX-87H，流動相為0.0275%(v/v)H2SO4，流速 0.6 mL/min。

1.2.3 酶活測定

粗酶提取:4℃，8 000 r/min離心1 min收集菌體，去上清液;用預冷雙蒸水重懸菌體，并于離心后去掉上清液;加入與菌體等量并預冷的蛋白提取緩沖液PEB，PEB中再加入100×PMSF;加入與菌體體積差不多量的玻璃珠;在振蕩混合器上振蕩EP管10次，每次30 s，每次振蕩后放冰上1 min;12 000 r/min離心10 min，取上清即蛋白液放于冰上保存。

丙酮酸脫羧酶:向比色皿中依次加入40 mmol/L咪唑鹽酸0.4 mL、1.5 mmol/L NADH 0.1 mL、880 U/mL乙醇脫氫酶0.1 mL、50 mmol/L MgCl20.1 mL、500 mmol/L丙酮酸鉀0.1 mL、細胞破碎上清液0.1 mL(對照加0.1 mL的咪唑鹽酸)，測定340 nm處吸光度變化。反應起始于丙酮酸鉀的加入，在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘能夠催化1 μg分子的輔酶 I的酶量為1個酶活單位。乙醇脫氫酶:吸取0.06 mol/L焦磷酸鈉溶液0.5 mL、3 mol/L乙醇溶液0.1 mL、0.005 mol/L NAD 溶液 0.1 mL、蒸餾水 2.2 mL置于石英比色杯中(容量4 mL)，加入已稀釋的樣液或酶制劑1 mL，立即混勻，測定A340，以后每隔15 s測1次，直至A340不變，記下反應時間和A340讀數。于另一石英比色杯中，以蒸餾水代替底物，作空白試驗。每分鐘A340增加0.001為1個活力單位。

1.2.4 基因敲除［16］

以質粒pUG27為模板，利用引物F和R(表1)進行 PCR擴增，PCR條件為95℃ 5 min;9℃ 30 s;55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30 個循環;72℃ 延伸 10 min。獲得的 PCR產物即為敲除盒，它含有His標記，loxP位點和PDC1(ADH1)基因同源的序列。然后利用LiAc轉化法將敲除盒直接轉化到S.cerevisiae CEN.PK2-1C，涂布在SD-His平板上，培養3～5 d。長出的單菌落劃線純化后接入SD-His液體培養基，培養后提取基因組，PCR驗證確定為陽性菌落。將用以消除標記的Cre表達質粒pSH47轉化到酵母陽性轉化子中，切除標記后，并將 pSH47移除，最終獲得陽性轉化子。

2 結果與討論

2.1 PDC1和ADH1雙基因缺失對菌體生長及耗糖的影響

考察了PDC1單獨缺失及PDC1和ADH1雙基因缺失對釀酒酵母細胞生長及耗糖的影響，結果如圖1所示。PDC1單獨缺失對菌體生長影響很小，但減弱了葡萄糖的消耗能力;PDC1和ADH1雙基因缺失后，發酵進行到36 h時，酵母細胞的生物量為2.64±0.16 OD600，較野生型菌株下降了75.3%。此時，雙基因缺失突變株葡萄糖消耗了22.9±1.9 g/L，對照菌消耗了62.5±0.6 g/L。說明PDC1和ADH1缺失后，在現有的發酵條件下，菌體生長和耗糖較弱。

圖1 野生型菌株與基因缺失株菌株生物量及葡萄糖消耗Fig.1 Growth(a)and glucose consumption(b)of the wild type，the pdc1 mutant and the pdc1adh1 mutant(Fermentation medium contains 100 g/L glucose)

2.2 PDC1和ADH1基因缺失對Pdc和Adh酶活的影響

考察了PDC1和ADH1基因缺失對Pdc和Adh酶活的影響，研究結果如圖2所示。在野生型菌株中，從24 h到48 h，Pdc酶活逐步增加，但是到第60 h又減少，48 h為最大值達到0.28 U/mg。而pdc1缺失株中，Pdc酶活從24 h至60 h都是逐步減少的，相同時間點酶活與野生型菌株相比顯著減少，48 h時的Pdc酶活僅有0.12 U/mg，與野生型菌株相比，減少了57.1%。同樣，無論在野生型菌株還是缺失株中，Adh酶活都是先增加后減少，在48 h達到最大值，其中野生型菌株Adh酶活達0.58 U/mg，缺失株為0.36 U/mg，而在相同時間點缺失株較野生型菌株相比 Adh酶活都減少，48 h、60 h相差顯著，說明ADH1基因缺失導致酶活降低，其中在48 h顯著降低40%。

圖2 丙酮酸脫羧酶以及乙醇脫氫酶酶活Fig.2 The specific activities of Pdc and Adh in the pdc1 mutant(a)and the pdc1adh1 mutant(b)

由圖1和圖2可知，PDC1單獨缺失對菌體Pdc酶活及菌的生長情況與文獻報道的結果基本一致［17］。PDC1和 ADH1基因的缺失，導致了 Pdc和Adh酶活的下降，進而影響了菌體生長和葡萄糖的消耗。NADH主要由胞質里的糖酵解途徑等產生，在好氧條件下，釀酒酵母對葡萄糖的吸收速率超過一定的閾值時，NADH產生的速率就會超過其被氧化的速率，導致釀酒酵母通過溢流代謝合成乙醇［7］。Adh1p作用是將乙醛轉化為乙醇，同時將 NADH轉化為NAD+，因此，ADH1的敲除，會影響到葡萄糖的代謝，進而影響到菌體的生長。

2.3 發酵優化提高菌體生物量

敲除基因PDC1和ADH1后，菌株生長較弱。為了提高菌體生物量，考察了葡萄糖濃度、C/N以及溶氧對雙基因缺失菌株生長的影響。重點比較了24 h和48 h的生長情況，結果如圖3所示。與高糖濃度相比，40 g/L葡萄糖對生長最有利，在48 h菌體生物量(OD600)達到 3.8，較 100 g/L葡萄糖提高了107.7%。當葡萄糖含量為40 g/L時，考察了不同氮源濃度及C/N對菌體生長的影響。研究發現，氮源為3.4 g/L YNB和5 g/L(NH4)2SO4對生長最有利，48 h時，菌體生物量(OD600)達到6.5，較對照提高了70.3%。此外，溶氧水平也能顯著地影響缺失株的生長，此實驗通過裝液量來實現。考察了40 mL、80 mL、100 mL的裝液量對菌株的影響，研究發現，裝液量為40 mL時，雙基因缺失株的菌體生物量(OD600)達到了9.1，與對照(100 mL)相比，提高了49.2%。綜上，本研究通過優化葡萄糖濃度、氮源濃度及C/N、溶氧水平，實現了菌體生物量(OD600)從最開始的1.8±0.15達到優化后的9.1±0.45，提高了4倍，接近于野生型菌株的最大菌體生物量。

圖3 pdc1adh1菌株生物量優化Fig.3 Growth optimization of the pdc1adh1 mutant

在本研究中，通過研究葡萄糖濃度、氮源濃度及C/N及溶氧水平對菌體生長的影響。實際上，PDC1和ADH1的缺失影響了葡萄糖的代謝，進而影響到菌體的生長。提高通風水平，可以明顯促進菌體生長，這個現象與Tokuhiro的研究結果(提高攪拌轉速，可以提高葡萄糖的消耗速率及菌體生物量)是一致的［15］。這是因為氧是電子受體，提高氧的供應，可以促進NAD+的再生，進而促進葡萄糖的代謝。

2.4 發酵特性研究

在上述最佳培養基及培養條件下，考察了野生型菌株和雙基因缺失菌株的發酵特性。如圖4所示，雙基因缺失菌株的菌體生長弱于野生型菌株，但發酵進行到48 h后，最大生物量接近于野生型菌株;雙基因缺失菌株的葡萄糖的消耗速率也低于野生型菌株，發酵進行到48 h時，葡萄糖消耗完;野生型菌株乙醇產量在36 h時達到最大值，為5.8 g/L，而雙基因缺失菌株的乙醇產量在48 h達到最大值，為2.1 g/L，較野生型菌株下降了63.8%;野生型菌株幾乎不積累丙酮酸，而雙基因缺失菌株的丙酮酸產量在48 h達到最大值，為2.0 g/L。由此可見，在優化后的發酵條件下，雙基因缺失菌株的菌體生長和葡萄糖消耗情況與野生型菌株接近。同時，通往乙醇的碳流大大減少，部分碳流以丙酮酸的形式積累，為目標產物C4二元羧酸的生產提供了前體物。

圖4 CEN.PK2-1C以及pdc1adh1缺失株發酵特性Fig.4 Fermentation profiles of the wild type and the pdc1adh1 mutant during batch culture under optimal growth conditions

3 結論

同時敲除基因PDC1和ADH1，可以弱化乙醇合成途徑中兩個關鍵酶Pdc和Adh兩個關鍵酶的活性，但導致菌體生長較弱;通過培養基優化及培養條件優化，確定了最優的培養基組成為:葡萄糖40 g/L，YNB 3.4 g/L，(NH4)2SO45 g/L。最佳裝液量為40 mL/250 mL。在此發酵條件下，菌體最大生物量與對照菌株接近，發酵48 h時，最大乙醇產量為2.1 g/L，較野生型菌株最大乙醇產量下降了63.8%，丙酮酸產量為 2.0 g/L。因此，通過敲除基因 PDC1和ADH1，可以同時弱化Pdc和Adh兩個關鍵酶的活性，進而有效減少乙醇的形成，促進丙酮酸的積累，為研究減少副產物乙醇形成，促進C4二元羧酸形成提供了一個可供選擇的策略。

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