酵母雙雜交系統及其應用研究進展

崔紅軍， 魏玉清

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021)

酵母雙雜交系統及其應用研究進展

崔紅軍， 魏玉清

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021)

酵母雙雜交系統作為一種有效研究蛋白質相互作用的分子生物學方法，具有真實、高效、敏感、廣泛的特點，被廣泛應用于諸如蛋白質組學、基因組學等領域。主要對酵母雙雜交技術的原理、特點及應用現狀進行了綜述。

酵母雙雜交系統；蛋白質相互作用；應用

蛋白質是細胞中的實際功能分子，具有負責細胞生物化學活性的功能，隨著生物化學和分子生物學研究技術和手段的不斷深入，蛋白質分子間的相互作用作為蛋白質組學研究的主要內容之一已成為近年來的研究熱點。蛋白質互作不但能夠提供蛋白質本身功能的信息，而且能夠提供蛋白質在代謝調控、信號傳導和復合體中起作用的信息[1]。篩選、分析蛋白質互作的方法有很多種，主要包括生物化學法，如共純化、親和純化和免疫共沉淀，質譜技術，離子體共振技術，生物物理技術，噬菌體展示技術和酵母雙雜交技術等[2]。目前，酵母雙雜交技術當屬研究蛋白質互作方法中較為高效、靈敏和簡便的一種方法。

1 酵母雙雜交系統的基本原理

酵母雙雜交系統是由Fields等[3]根據真核轉錄調控的特點于1989年首次提出并建立，可直接于細胞內檢測蛋白質的相互作用。其原理為：真核生物有上游激活序列(UAS)，在轉錄水平上進行基因的表達調控，如酵母轉錄因子GAL4含有2個或2個以上的結構域，其中包括2個極其重要且可以彼此分割開的結構域，DNA結合結構域(DNA-binding domain, BD)和DNA轉錄激活結構域(Transcription- activating domain, AD)。BD識別并結合于效應基因上游激活序列，AD與BD結合成轉錄復合體，從而激活UAS下游報告基因的轉錄。AD和BD的單獨存在并不能激活下游基因的轉錄作用，只有兩者在空間上互相接近，下游報告基因才能得以表達。BD與表達已知蛋白X的基因片段連接，構建成BD-X質粒載體，AD與cDNA文庫表達未知蛋白Y的基因片段或基因突變體Y連接，構建成AD-Y質粒載體，把蛋白X和Y分別稱為誘餌蛋白(bait)和靶蛋白(prey)，將BD-X和AD-Y共同轉化到酵母菌體內，此酵母菌體內有報告基因(LacZ、His、Leu、Trp、ADE等[4])而本身并無報告基因轉錄活性。當BD-X和AD-Y這2個融合蛋白表達并相互作用時，則在空間結構上將AD和BD拉近，從而形成轉錄因子，激活UAS下游報告基因的表達，使此轉化體可以在His、Leu、Trp、ADE等特定營養缺陷培養基上生長，并由于LacZ報告基因的表達，酵母菌會分泌β-半乳糖苷酶，X-gal在β-半乳糖苷酶的存在下，會變成藍色底物，從而使陽性菌落呈藍色。當BD-X和AD-Y不融合時，下游基因不表達，據此分析判斷2個蛋白是否相互作用。在目前通用系統中,根據BD來源不同可分為GAL4系統和LexA系統。真核細胞中是GAL4系統;原核細胞中是LexA系統,其轉錄啟動因子是LexA。

2 酵母雙雜交系統的研究歷史

酵母雙雜交系統在應用中得到不斷改進和完善，并衍生出幾個新的系統。1993年，Li等[5]提出酵母單雜交系統，在單雜交系統中無需轉錄激活結構域和誘餌蛋白的融合蛋白與DNA結合結構域和靶蛋白的融合蛋白結合來激活報告基因的表達，轉錄激活結構域融合蛋白可直接與特異DNA序列結合激活報告基因表達，單雜交系統是研究轉錄因子分離鑒定的有效方法[6]。1996年,Vidal等[7]提出反向酵母雙雜交系統，即使用表達產物對酵母菌本身有毒性的報告基因，當誘餌蛋白和靶蛋白沒有相互作用或者相互解離時酵母菌株能夠正常生長。此雙雜交模式更適用于研究蛋白質間作用位點或者利用抑制或阻斷蛋白質間相互作用來尋找藥物。1996年，Sengupta等[8]提出酵母三雜交系統，它與雙雜交的不同在于激活結構域融合蛋白與結合結構域融合蛋白之間的相互作用需要第三組分的介導來完成，該組分可為RNA、蛋白質或小分子物質。1997年，Aronheim等[9]提出Sos招募系統，其原理為哺乳動物的Ras鳥苷酸交換因子Sos蛋白為一種胞質蛋白，酵母中其同源Ras鳥苷酸交換因子Cdc25蛋白定位于細胞膜上。Cdc25突變可產生溫度敏感缺陷型細胞，使酵母菌株不能在37 ℃下生長，可將Sos蛋白定位在細胞膜上代替Cdc25蛋白的作用，激活Ras信號通路，恢復酵母菌株在37 ℃條件下生長的能力。酵母雙雜交及其衍生系統在蛋白質與蛋白質間、蛋白質與核酸間以及蛋白質與其他小分子間互作的研究中起著舉足輕重的作用。

3 酵母雙雜交系統的主要特點

酵母雙雜交技術可以精確地分析已知蛋白間的相互作用，以及篩選編碼未知蛋白的基因，具有真實性、敏感性、高效性、廣泛性等[10]特性。即便雙雜交是檢驗蛋白質互作的有效方法，其自身也存在缺點，如易產生假陽性、假陰性等。

3.1 酵母雙雜交系統的優點

(1)檢測蛋白質的相互作用是在真核細胞內進行，在核酸水平上操作，避免了蛋白質的分離純化過程，保證了蛋白質的活性，所以能更加真實地反映蛋白質互作情況。

(2)報告基因表達產物的積累，使雙雜交技術能敏感地檢測到蛋白質間微弱、暫時的作用。

(3)可以直接從cDNA文庫中篩選與已知蛋白質相互作用的基因片段。雙雜交技術應用廣泛，可采用不同類型細胞構建cDNA文庫，分析不同類型細胞的蛋白質功能。

(4)酵母菌有不同的標記基因：營養缺陷型基因、抗性基因，易于相互作用的蛋白質的篩選。

3.2 酵母雙雜交系統的局限性及改進

(1) 假陽性。假陽性是酵母雙雜交中的主要問題。由于某些蛋白質本身具有激活報告基因表達的功能，無需誘餌蛋白和靶蛋白的特異性結合，某些蛋白和空載體的結合也可激活轉錄系統，抑或是某些蛋白質表面有其他蛋白質的低親和力區，易于激活報告基因的表達，產生假陽性現象。針對上述不足，研究者們對報告基因進行改進[11]，對其載體構建策略進行改進[12]等，提出雙篩選系統和假陽性顯示分析法，顯著減少假陽性的產生。

(2) 假陰性。假陰性雖不是酵母雙雜交中的主要問題，但仍需重視。其常見原因：一是兩蛋白質間作用微弱使得報告基因不表達或表達量少而使其難以檢測，對其進行改進應選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。二是誘餌蛋白和靶蛋白融合體的表達對細胞有毒害作用，應選擇敏感性低的菌株或拷貝數低的載體[8]。

(3) 核內反應。利用酵母雙雜交研究互作蛋白質必須定位在細胞核內，這限制了核外蛋白質的研究。針對此現象，產生了Sos恢復系統[9]，將互作蛋白的研究場所轉移到細胞質中。

(4) 此外，蛋白質轉化率的高低是成敗的關鍵。研究表明質粒轉化過程中共轉化比依次轉化效率高[13]。

4 酵母雙雜交系統的應用

酵母雙雜交作為具有開創意義的研究方法，是研究蛋白質互作，蛋白質結構與功能的重要手段，目前已廣泛應用于蛋白質與蛋白質間、蛋白質與核酸間以及蛋白質與其他小分子間相互作用的研究。該技術也可用于大規模蛋白質間互作的研究,具有易于自動化、高通量[14]等特點。

4.1 檢測已知蛋白質間的互作建立酵母雙雜交系統最初是為了研究已知蛋白間的互作。至今應用雙雜交系統已證實了大量蛋白質間的相互作用。如已知玉米類pto和類ptil基因參與逆境脅迫的信號傳導，鄒華文等[15]利用雙雜交技術初步確定只有Zmpto和Zmptil相互作用時才能激活報告基因的表達。柑橘衰退病毒(CTV)能引起柑橘衰退病，CTV編碼的外殼蛋白CP和P20蛋白均存在自身互作，Chofong等[16]運用雙雜交技術分析和GST-pulldown體外驗證，表明P20氨基酸序列N端的1～21位氨基酸及CP氨基酸序列N端的41～84位氨基酸對自身互作具有重要作用。PML是與急性早幼粒細胞白血病(APL)發病機制相關聯的蛋白質，包含PML的coild-coil結構域，命名為PML-C。2010年，朱丹等[17]從白血病cDNA文庫篩選出包含CYPN2蛋白在內的9種與PML-C結構域相互作用的蛋白質，為闡明APL發病機制提供新的思路。2012年，吳秀娟等[18]利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀試驗進一步驗證PML-C和CYPN2之間的相互作用，PML-C和CYPN2作用形成的復合物可能影響CYPN2的正常功能，與APL發病有重要關系。

4.2 發現新蛋白及蛋白新功能酵母雙雜交最重要的用途是從cDNA文庫中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白[19]，繼而研究蛋白互作效應。目前研究者應用雙雜交系統已經發現許多新蛋白。如崔雨明等[20]利用酵母雙雜交技術在人白細胞文庫中篩選到8個與流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白，為探索流感病毒致病機理指明了一定方向，提供一定理論基礎。 GsCBRLK在 ABA 及鹽脅迫誘導的鈣離子信號通路中起著關鍵調節作用，為更加深入地研究GsCBRLK的作用機制，楊姍姍等[21]應用酵母雙雜交篩選到SNARE和14-3-3兩種與GsCBRLK互作的蛋白。獨腳金內酯(SLs)是一種抑制植物分枝的新型激素，其合成及信號傳導途徑尚不清楚，王濤[22]以多個水稻矮化多分蘗突變體包為試驗材料研究SLs，利用酵母雙雜交等方法篩選到與SLs信號途徑中D3和D14互作的蛋白質，為闡明SLs調控水稻分蘗、植物分枝的作用機制奠定了理論基礎。為明確不結球白菜 Pol胞質雄性不育相關基因的信號傳遞通路,錢瑜等[23]構建了不結球白菜Pol胞質雄性不育花酵母雙雜交cDNA文庫，篩選到與細胞色素C還原酶鐵硫蛋白( BCRISP1)互作的蛋白CYP81G和PIP2。

4.3 篩選多肽類藥物及尋找藥物作用位點分子間相互作用可能導致疾病的產生，研究表明，多肽類藥物對治療癌癥和病毒類等疾病最有效。利用酵母雙雜交技術篩選與來源于腫瘤、細菌及病毒的蛋白間相互作用的多肽類藥物，分析疾病發生機理，確定藥物互作蛋白在腫瘤、細菌及病毒中的位置，有目標性地干擾疾病蛋白的表達，已達到治療疾病的預期效果。Waheed等[24]利用細菌逆向雙雜交篩選出一種細胞周期蛋白，可干擾Gag蛋白與TsG101的結合，阻斷 HIV-1在宿主內的出胞過程。秦咸蘊[25]運用雙雜交篩選出引起手足口病的腸道病毒EV71的抑制活性中藥，為治療腸道病毒疾病提供了理論基礎。人巨細胞病毒(HCMC)是導致胎兒中樞神經系統異常的一種感染性病原，王慧等[26]利用酵母雙雜交發現鼠巨細胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122 蛋白與宿主因子Myst4相互作用的結合位點位于M122蛋白的1～148氨基酸，為預防和治療MCMV導致的神經系統異常提供一定的理論基礎。

4.4 建立蛋白質互作網絡許多蛋白在功能上是互相聯系的，在生命活動中彼此協調控制。隨著基因組計劃的完成，大量開放閱讀框產生，研究閱讀框的功能成為后續任務，這些基因的功能由其編碼產生的蛋白質體現，利用酵母雙雜交技術研究蛋白互作，并向大規模、自動化、高通量方向成熟[27]，建立起蛋白質互作網絡。建立蛋白質互作網絡能更加系統地了解生命活動，尋找有利蛋白，解決困擾人類的重大疾病[28]等。郜盡[29]在研究肝臟調控相關轉錄因子時選擇32個ORF為誘餌篩選互作蛋白，繪制肝臟再生過程中轉錄因子互作網絡，為肝臟蛋白質組學研究提供新思路。加拿大和美國科學家組成的一個國際研究小組，繪制出迄今最大規模的人類基因組編碼蛋白間直接相互作用的圖譜，并預測出數十個與癌癥相關的新基因，包括蛋白質間 1.4 萬個直接相互作用[30]。相信完成此項研究將會解釋困擾人類的眾多問題。

5 存在問題與展望

酵母雙雜交系統自建立以來，雖存在假陽性、假陰性等局限性，但仍處于不斷改進和完善的過程。因其快速、靈敏、高效的特征被廣泛應用于蛋白質間的相互作用，蛋白質與基因的結構功能，新型多肽類藥物的開發與利用等多個領域，并在此基礎上衍生出酵母單雜交系統、反向酵母雙雜交系統、酵母三雜交系統及Sos恢復系統等。為人類提供大量生物學信息，為人類獲得生物體內蛋白質間作用關系的有效途徑。隨著科學研究的不斷深入，相信酵母系統必將發揮越來越重要的作用。

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Review on Application Status of Yeast Two Hybrid System

CUI Hong-jun, WEI Yu-qing

(College of Bioscience and Bioengineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan, Ningxia 750021)

The yeast two hybrid system, as a kind of effective molecular biology method for studies of protein interactions, is real, effective, sensitive, and popular, which is widely used in proteomics, genomics and other fields. The principle, characteristics and application status of yeast two hybrid technology were reviewed.

Yeast two hybrid system; Protein-protein interaction; Application

北方民族大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201311407019)。

崔紅軍(1990- )，女，河北河間人，本科生，專業：生物工程。

2015-03-24

S 188

A

0517-6611(2015)13-045-03