桃褐腐病防治及抗藥性研究新進展

裴慶慧， 田平芳， 葛喜珍*

(1. 北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029)

桃褐腐病防治及抗藥性研究新進展

裴慶慧1， 田平芳2， 葛喜珍1*

(1. 北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029)

介紹了用于防治桃褐腐病菌的化學防治、物理防治、微生物防治及植物源農藥防治等方法的研究進展，其中重點闡述了化學農藥β-微管蛋白抑制劑(BZIs)、甾醇脫甲基酶抑制劑(DMIs)、二甲酰亞胺類殺菌劑(DCFs)、苯醌外部抑制劑(QoIs)和琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs)的抗菌機制及桃褐腐病菌的抗藥性機理，最后展望了今后的研究方向。

桃褐腐病菌；抗菌機制；抗藥性；防治

桃褐腐病菌[Moniliniafructicola(Winter.) Honey.]在自然界廣泛分布。侵染李屬植物的桃褐腐病菌主要有3種：Moniliniafructigena(Aderhold & Ruhland) Honey、Moniliniafructicola(G. Winter) Honey和Monilinialaxa(Aderhold & Ruhland) Honey，在我國廣泛流行的桃褐腐菌有M.fructicola、M.mumecola和M.yunnanensissp. nov[1]。桃褐腐病菌主要危害桃樹的花、葉、枝及果實，果實受害最重，果實成熟前后、儲藏期均可發病。筆者綜述了用于防治桃褐腐病菌的化學殺菌劑、生物防治、物理防治及植物源農藥防治等方法，以期為桃褐腐菌的防治提供新思路。

1 化學防治

防治桃褐腐病的常用化學殺菌劑主要包括BZIs、DMIs、QoIs、DCFs和SDHIs，使用化學殺菌劑雖然降低了桃褐腐病的發生，但由于作用靶點單一，桃褐腐病菌易產生抗藥性，降低防效。

1.1 BZIs

1.1.1BZIs殺菌機制。β-微管蛋白抑制劑主要是苯并咪唑(BZIs)類殺菌劑，其母體結構中均有1個苯并咪唑的活性基團，屬于內吸性殺菌劑，有多菌靈、噻唑靈、麥穗寧等[2]。由于甲基托布津在生物體中主要代謝為多菌靈，故將其歸入該類化合物。該類殺菌劑抗菌譜廣，應用廣泛，主要作用于病原菌的β-微管蛋白，使微管形成受阻，破壞紡錘絲的形成，干擾細胞分裂，起到殺菌作用[3]。

1.1.2BZIs殺菌劑抗藥性新進展。BZIs殺菌劑的長期應用使多種植物病原菌對其產生了抗性。早在1978年就報道了桃褐腐病菌對苯并咪唑類的苯菌靈產生抗藥性[4]。分子水平研究表明，植物病原真菌對BZIs殺菌劑產生抗性大都與β-微管蛋白基因的點突變有關，即桃褐腐病菌的β-微管蛋白基因密碼子第6位CAT→TAT(組氨酸突變成酪氨酸，H6Y)、第198位GCA→GAA(谷氨酸突變成丙氨酸，E198A)，導致β-微管蛋白的構象發生變化，此外還發現該突變型的表現與溫度有關，高抗性菌株在31 ℃時對苯菌靈不產生高抗性，低抗性菌株在低于15 ℃時不表現抗性，高抗性菌株適應環境的能力差，不易存活[5]。

Fan等對我國南方分離出的高抗性和低抗性菌株β-微管蛋白基因進行測序，發現其與美國加州抗性菌株有相同的點突變[6]。而采集自馬里蘭和賓夕法尼亞州的桃褐腐病菌BZIs抗性菌株并未發生之前報道的E198A突變，而是E198Q或者F200Y[7]，提示病原菌的來源與產生抗性機制的相關性。Fan等發明的實時定量PCR檢測技術可快速、定量檢測出導致桃褐腐病菌產生抗藥性的H6Y、E198A突變[8]，在BZIs抗性菌株發生及其頻率檢測方面具有廣闊的應用前景。

1.2 DMIs

1.2.1DMIs殺菌機制。DMIs于20世紀70年代首次用于病害防治，具有內吸性。其代表性殺菌劑有腈苯唑、戊唑醇、丙環唑、苯醚甲環唑等。其作用機制是其雜環上的氮原子與病原真菌羊毛甾醇C-14α-脫甲基酶(Cyp51)的血紅素-鐵活性中心結合，抑制C-14α-脫甲基酶的活性，阻礙病原菌麥角甾醇的合成，從而導致細胞死亡[9]。腈苯唑是目前唯一在國內登記的用于防治桃褐腐病的殺菌劑。

1.2.2DMIs殺菌劑抗藥性新進展。病原真菌對DMIs產生抗性的可能機制主要有3種：靶標基因MfCYP51的過表達和點突變、編碼ABC 運輸蛋白和MFS運輸蛋白基因的過量表達[10]。研究表明，在MfCYP51基因的上游調控區存在一個插入片段(Mona)，由于Mona的存在導致下游MfCYP51基因的過表達，從而使病原菌對DMIs殺菌劑產生抗性[7,11-12]。Chen等采集北京地區不同果園的100株桃褐腐病菌，對其中表現DMIs抗性的菌株進行基因分析，發現編碼DMIs殺菌劑靶標蛋白的基因發生突變(Y136F)，但這一突變反而不利于菌株生長，因此在世界范圍內，該突變位點不是DMIs殺菌劑抗性菌株的抗性決定因子[13]。Holb等研究發現，DMIs殺菌劑中加入硫元素可增強其抑菌效果，二者有小幅協同效應，可增加抗性菌株對DMIs殺菌劑的敏感性[14]。

1.3 DCFs

1.3.1DCFs殺菌機制。DCFs因殺菌譜廣、防效顯著，被廣泛用于多種真菌病害的防治。其代表性殺菌劑有腐霉利、異菌脲、乙稀菌核利、速克靈和撲海因等，上述殺菌劑化學結構式都存在1個3,5-二氯苯基基團。DCFs類殺菌劑的作用機理較復雜，目前尚未徹底闡明，其中最經典的是有氧自由基介導的細胞毒假說[15]，其作用機制也有可能與滲透壓感受器雙組分組氨酸激酶(HK)相關。

1.3.2DCFs殺菌劑抗藥性新進展。早在20世紀80年代新西蘭果園中就出現了對DCFs具有抗性的M.fructicola菌株[16]，但其抗性機制尚不十分明確。桃褐腐病菌抗異菌脲的突變體由雙組分組氨酸激酶的單點突變造成[17]。此外，調控胞內甘油合成的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中Sln1和 Hog1元件及它們的同源基因也與抗藥性相關[18]。HK基因[19]、BcOs4基因[20]、Botrytiscinerea的Daf2基因[21]、依賴cAMP 的絲氨酸蛋白激酶(Ser/Thr PK)途徑相關的ubc1基因[22]等也與DCFs抗性有關。

1.4 QoIs

1.4.1QoIs殺菌機制。QoIs作為一大類內吸性殺菌劑，具有廣譜抗菌和環保優勢。其代表性藥物有嘧菌酯、嘧菌胺等，它是一類作用于病原菌線粒體電子傳遞鏈上cyt-bc1 酶復合物Qo中心的一類藥劑，主要包括甲氧丙烯酸酯類和噁唑烷酮類藥劑。QoIs作用于病原菌線粒體細胞色素bc l復合體(復合體III)上的Qo位點，阻斷電子從細胞色素b到cl間的傳遞，干擾病原菌中ATP的合成，進而起到殺菌作用[23]。

1.4.2QoIs殺菌劑抗藥性新進展。對QoIs類殺菌劑產生抗藥性是由于細胞色素b基因(Cytb)發生突變(主要為143位的甘氨酸突變為丙氨酸，G143A)。Hily等對M.fructicola、M.laxa和M.fructigena的細胞色素b基因進行分析，在所有受試菌株中未發現與QoIs抗性相關的典型點突變，M.fructicola和M.laxa的cytb基因有一組內含子直接跟在143位密碼子后，但在M.fructigena上未發現，即M.fructicola和M.laxa很可能不會因為G143A而產生QoIs抗性，M.fructigena可能由于G143相關內含子的缺失而更可能產生QoIs抗性[24]。Luo等首次報道了M.fructicola的Cytb基因的全部序列，并研究發現除非M.fructicola缺失了1 166 bp內含子，否則很難發生G143A突變[25]。

一些病原真菌對QoIs類殺菌劑產生抗藥性是因為激活了另一條包括MfAOX1基因編碼的氧化酶在內的呼吸通路。Schnabel等分析了QoIs抗性桃褐腐病菌的交替氧化酶MfAOX1基因，發現用嘧菌酯誘導M.fructicola，并非所有的菌株都能表達MfAOX1基因，2.0 μg/ml嘧菌酯可充分誘導MfAOX1低組成型表達[26]。另有報道發現QoIs殺菌劑的抗性可能與運輸體蛋白的過量表達有關[27]。

1.5 SDHIs

1.5.1SDHIs殺菌機制。SDHIs是新劃分的一類作用機制和抗性機理相似的化合物。1960年開始使用萎銹寧，之后的SDHIs殺菌劑有氟酰胺和啶酰菌胺等，目前已成功開發的該類殺菌劑至少有15個品種，近年推出的主要產品如聯苯吡菌胺、環苯吡菌胺、氟唑菌苯胺、雙環氟唑菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺和吡噻菌胺等新品種，殺菌譜很廣。

SDHIs類殺菌劑與QoIs類藥劑類似，也是呼吸類抑制劑，其作用靶點為病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈上的蛋白復合體II[28]，主要是抑制病原菌琥珀酸脫氫酶(SDH)或琥珀酸-泛醌還原酶(SQR)的活性，特異地中斷電子在鐵硫簇[3Fe-4S]到泛醌之間的傳遞[29]。其藥效強且作用持久。

1.5.2SDHIs殺菌劑抗藥性新進展。病原菌對SDHIs殺菌劑產生抗性早有報道[30]，其抗性機制多是構成線粒體復合物II各亞基的SDHA、SDHB、SDHC和SDHD核酸序列發生了突變[31]。

關于桃褐腐病菌對SDHIs殺菌劑抗性機制的報道較少。2008年從美國加州南部和芝加哥分離的桃褐腐病菌對SDHIs殺菌劑的敏感性明顯降低[32]。Chen等研究了對SDHIs殺菌劑不同敏感程度的桃褐腐病菌株，克隆并分析了構成線粒體復合物II各亞基的SDHA、SDHB、SDHC和SDHD核酸序列，發現盡管各菌株之間的基因序列存在差異，但未發現與抗性相關的單一變化。分析不同年份果園中的菌株，發現包括啶酰菌胺抗性菌株在內，均對啶酰菌胺有一個敏感范圍(EC50=0.03～3.46 μg/ml)[33]。

2 微生物防治

2.1 桿菌屬防治Zhou等從44株菌篩選具生物抑菌活性的菌株，與對照組相比，桿菌屬C06菌株(Bacillussp. C06)菌液對桃褐病病菌的抑菌率為90%，表明該C06菌株作為拮抗菌防治桃褐腐菌具有很大潛力[34]；Pimenta等通過基于DNA的抑制性消減雜交方法，利用MALDI-TOF-MS分析，證明解淀粉芽孢桿菌C06(B.amyloliquefaciensC06)中抑菌成分是由bmyC和fenD編碼的bacillomycin D和fengycin 2種脂肽，該2種脂肽聯合發揮殺菌作用[35]。

2.2 酵母及酵母類似物防治酵母和酵母類似物環境友好、成本低。安格斯畢赤酵母(Pichiaangusta)對桃褐腐病菌表現顯著的抑制效果，而亮氨酸營養缺陷型突變畢赤酵母則無該活性，在蘋果褐腐病傷口上添加0.6～1.2 g/L亮氨酸，突變畢赤酵母的生物防治活性完全復原[36]；食品添加劑鉬酸銨(NH4-Mo)、碳酸氫鈉(NaBi)與膜醭畢赤酵母(Pichiamembranefaciens)或羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)聯合使用可提高拮抗酵母的抑菌效果，推測是添加劑影響拮抗酵母的生長[37]；發酵畢赤酵母(Pichiafermentans)在蘋果表面形成很薄的生物被膜，起到良好的防治作用，但其作用到桃上不僅無抑菌作用反而會加速桃的腐爛，推測與發酵畢赤酵母不能在桃果實上過渡到假菌絲生長期有關。該現象不僅說明假菌絲的生長在畢赤酵母抑菌作用中的重要性，同時也說明評價新的生物防治劑的安全性是很必要的[38]。Mari等從“redhaven”桃中分離出的L1和L8 2種出芽短梗霉(Aureobasidiumpulluans)，分別使用1×107和1×108cfu/ml就能明顯抑制鏈核盤菌屬(M.laxa、M.fructicola和M.fructigena)[39]。用短梗霉菌株PL5處理接種了M.laxa病菌的桃果實，病斑直徑明顯減小[40]。

2.3 其他微生物防治Pimenta等從李樹上分離出內生真菌，其中4株菌可產生乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、乙酸、2-丙炔-1-醇、2-丙烯腈等抑制桃褐腐病菌物質，這些真菌產生的揮發物可抑制菌絲生長，使菌絲內溶、解體，是一種良好的生物抑菌劑[41]。Larena等發現采前將黑附球菌(Epicoccumnigrum)的孢子液噴灑到桃樹花朵及果實上，桃褐腐病菌的發病率可降低50%[42]。微生物防治桃褐腐病的研究起步較晚，主要涉及桿菌屬和酵母及酵母類似物，其作用機制和耐藥性有待進一步研究。

3 物理防治

3.1 氣體防治Tian等發現，在0 ℃條件下桃褐腐病菌對高濃度CO2非常敏感，在0 ℃、CO2濃度為10%～30%時能完全抑制病菌生長，且未發現高濃度CO2對在相同條件下的甜櫻桃造成任何質量和風味損失[43]。Qadir等用N2O作抑菌劑，抑制多種采后真菌，在20 ℃、20 kPa 氧氣存在的靜態系統中，N2O的壓力自10 kPa 變化到80 kPa可將桃褐腐病菌完全抑制，桃褐腐病菌對N2O表現高敏感性。他們認為N2O與CO2的抑制作用相同，均競爭性抑制C2H4作用，或抑制甲硫氨酸的生物合成[44]。另有研究表明，低濃度NO氣體也可有效抑制桃褐腐病菌的生長[45]。

3.2 蒸氣或熱處理等醋蒸氣作為一種液體殺菌劑可用于防治真菌分生孢子引起的果實病害。1.0 ml 紅酒醋(6.0%醋酸)可有效減輕桃褐腐病菌引起的杏(Prunusarmeniaca)腐爛[46]。Liu等發現利用40 ℃熱水處理果實5和10 min，可有效抑制桃褐腐病的發生，熱處理不僅直接抑制桃褐腐病菌的生長，而且使桃內幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶的活性有所上升，有利于減少桃果實腐爛，且該熱處理方法未損害果實質量[47]。Al-Haq等研究發現氧化電解水可作為表面殺菌劑，有效延緩桃褐腐病的發展[48]。

3.3 其他物理防治措施花期、接種濃度、溫度、濕度都會明顯影響桃褐腐病菌引起的花枯病[49]。果實發育階段、接種濃度、相對濕度大于90%的總時間、露期總時間等因素影響到隱性感染的發病率和果實的腐爛情況[50]。時機不當的疏果、旺季灌溉會引起空氣中真菌孢子濃度的增加，感染果實[51]，通過控制上述環境條件可控制桃褐腐病。

4 植物源農藥防治

隨著植物殺菌成分的商品化，植物源殺菌劑近幾年迅速發展。早在1989年就有報道1 389種植物有可能作為殺菌劑，植物中的抗毒素、類黃酮、與病程相關的蛋白質、生物堿、有機酸和酚類化合物等均具有殺菌或抗菌活性[52]。

4.1 小檗堿抑菌

4.1.1小檗堿抑菌研究現狀。筆者所在研究團隊發現黃連(Rhizomacoptidis)提取物對桃褐腐病菌有很強的抑菌效果，進一步研究發現其有效成分為小檗堿，其有效中濃度(EC50)和最小抑菌濃度 (MIC) 分別為4.5和46.9 μg/ml，在濃度高達400.0 μg/ml時，未觀察到小檗堿對桃果實產生細胞毒性。小檗堿不僅能抑制孢子萌發和菌絲生長，還能抑制角質酶的活性[53]。桃褐腐病菌可利用自身分泌的角質酶分解果實表皮中的角質類物質，侵染桃果實，造成嚴重腐爛[54]。小檗堿和多菌靈復配具增效作用，即在小檗堿中加入微量多菌靈就能增強其抑菌效果[55]。采用乳化-化學交聯法制備的負載小檗堿的殼聚糖微球對病原真菌的抑制作用較好，持續 30 d的藥物釋放試驗表明，小檗堿可從微球中緩慢釋放[56]。殼聚糖因具良好的成膜性、生物降解性、生物相容性、無毒性和抗菌性能而成為最具前景的載藥材料，小檗堿-殼聚糖復合膜不僅保鮮抑菌效果好，且使用方便、環保、成本低，用該膜包裝桃果實并保存于4 ℃下，可使桃果實保質期延長40 d，小檗堿-殼聚糖復合膜適用于防治桃存儲期病害[57-58]。

4.1.2小檗堿抑菌機理。關于小檗堿抗微生物機制的研究較分散。有研究推斷小檗堿可能通過影響細菌 DNA 的合成等發揮抗菌作用；小檗堿與四環素類的立體結構有很大的重合，推測其抗菌機制可能與四環素類藥物相同，即通過抑制細菌核蛋白體 30 S亞基而影響蛋白質的合成；還有報道認為小檗堿與蛋白或膜蛋白的非特異性結合是其抗菌的主要原因[59]。Kim等研究發現小檗堿對G+菌的stortase酶的活性有很強的抑制作用，推斷抑制 stortase 酶的活性可能是小檗堿的抗菌機理之一[60]。Wang等研究表明小檗堿能改變DNA分子的空間結構，并通過抑制啟動子中TATA基因盒子與其特異蛋白TBP結合而抑制轉錄[61]。Islam等研究發現小檗堿可部分嵌入tRNA[62]。目前關于小檗堿抗桃褐腐菌的分子機制鮮有報道，應明確小檗堿作用于桃褐腐菌的靶點，并進行靶點修飾，提高藥效。通過建立受小檗堿脅迫的差異cDNA文庫和同位素追蹤等方法，可望揭示小檗堿對桃褐腐病菌的作用靶點。研究表明小檗堿不易產生耐藥性[59]，這是否與其多作用靶點有關尚需深入研究。

4.2 其他植物源抑菌成分Feng等發現0.8、1.6和3.2 mg/ml黃柏 (CortexphellodendriChinensis)提取物(PBE)能分別完全抑制桃褐腐病菌分生孢子萌發、菌絲生長和產孢，PBE處理的桃樹過氧化物酶、苯丙氨酸氨-裂合酶、幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶等防御酶活性較高，PBE還可抑制儲存中果肉褐變[63]。甜櫻桃表面涂抹1 000.0 μg/ml百里香酚和香芹酚，褐腐病發病率分別降至24%和23%[64]。用1 mg/L麝香草酚蒸汽熏蒸可延緩M.fructicola菌絲生長，降低分生孢子萌發率，且發現熏蒸后的孢子變小、原生質體發生塌陷；體內試驗也發現通過醋酸或麝香草酚熏蒸可大大降低褐腐病的發病率[65]。煙熏500～1 000 μl檸檬桃金娘精油就能使M.fructicola孢子萌發率降至2%，抑制菌絲的生長，降低果實表面發病率[66]。

5 其他防治

Yang等研究發現，殼寡糖和硅能有效抑制桃褐腐病菌的孢子萌發和菌絲生長，其抑制效果與濃度成正比，且二者在蘋果果實上聯合使用表現出協同作用[67]。Qin等發現食品添加劑NH4-Mo和NaBi單獨使用也可有效控制甜櫻桃上的桃褐腐病，且效果與其濃度成正比[37]。

6 展望

目前防治桃褐腐病最有效的方法依然是化學殺菌劑，其他防治方法可作為補充措施。大多數化學殺菌劑具單一且準確的作用靶點，雖然抑菌作用明顯但又極易產生抗性?；瘜W農藥殘留威脅人類健康。新型綠色植物源殺菌劑、生物、物理或者其他防治措施綠色、環保，在推廣中還需進一步實踐，同時需研究其抗菌機制和病菌抗藥性。國內外學者采用植物源提取物防治桃褐腐病[52,55-56,64]，但目前研究基本處于初期階段，主要集中在實驗室篩選、室內毒力測定、安全性評價等，而田間應用報道較少。筆者所在團隊用小檗堿抑制褐腐菌，并進行室內毒力測定、復配、劑型、作用機理、抗性機制和大田試驗，制備成小檗堿復方制劑[54-58]。與單純的化學農藥相比，該植物源復方殘留低、抗菌效果好、成本低、環保、適于有機農產品生產。今后擬進一步研究桃褐腐病菌、小檗堿、活體(桃)三者之間防御應答反應和抗性機制，為桃褐腐病的田間防治提供合理的施藥方案。

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Advances in Disease Control of Peach Brown Rot and Resistance Mechanism ofMoniliniafructicola

PEI Qing-hui1, TIAN Ping-fang2, GE Xi-zhen1*

(1. Biochemical Engineering College of Beijing Union University, Beijing 100023; 2. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029)

Disease control strategies including chemical control, physical control, microbial control, and that using botanical fungicides were summarized. The antifungal mechanisms of the fungicides including benzimidazoles inhibitor(BZIs), sterol demethylation inhibitor(DMIs), Qo respiration inhibitors(QoIs), dicarboximides fungicide(DCFs) and succinate dehydrogenase inhibitors(SDHIs) were reviewed. Furthermore, the underlying resistance mechanisms ofMoniliniafructicolato aforementioned fungicides were also discussed. The future research direction was forecasted.

Moniliniafructicola; Antifungal mechanism; Resistance mechanism; Disease control

北京市教育委員會創新能力提升計劃項目(2015)。

裴慶慧(1989-)，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：微生物代謝工程。*通訊作者，教授，博士，從事化學和植物源農藥研究。

2015-03-27

S 436.621.1+3

A

0517-6611(2015)13-117-05