農藥學中的化學生物學實驗教學探索與創新

李向陽

(貴州大學精細化工研究開發中心，貴州貴陽550025)

農藥學中的化學生物學是農藥學與生物學等學科領域相互交叉、相互滲透的產物，正在成為一門重要的新興交叉學科。農藥學中的化學生物學研究一般都是以對植物體的生理或病理過程中具有干預或調控作用的小分子生物活性的化合物為基礎，發現其在植物體中的分子靶標，研究這些化合物與植物體中的靶標分子之間的相互作用，進一步采用農藥學方法改造其結構，通過生物測試篩選出具有某種生物活性的化合物，探討其結構與生物活性之間的關系，進一步研究其作用機制，闡明植物生理或病理過程的發生、發展與調控機制，揭示植物病菌病害的致病分子機理，開發新型高效安全的綠色農藥。結合了傳統的天然產物化學、農藥化學、生物化學、分子生物學、結構生物學和計算機輔助設計學等學科的部分研究方法，大大拓寬了研究領域［1］。

農藥學的創新是尋找農藥新靶標，開展農藥靶標的化學生物學研究，建立一些有結構生物學基礎的農藥分子設計生物模型［2-4］。例如，中科院昆明植物所郝小江研究員從馬藍中發現了多裂孕烷醇，可高效抑制煙草花葉病毒(TMV)病毒亞基因組的復制［5］。南開大學席真教授發現牛心撲子草活性成分NK007可高效抑制TMV病毒組裝，提出NK007的作用靶標位于TMV核糖核酸(RNA)的起始堿基上［6］。貴州大學宋寶安教授通過人工合成的方法獲得了Dufulin，并發現其可以激活煙草水楊酸信號通路，它的作用靶點位于煙草的細胞壁受體蛋白(HrBP1)上［7-8］。筆者所在的課題組通過凝膠排阻色譜法(SEC)、非變性聚丙烯酰胺電泳法(Native-PAGE)和等溫滴定量法(ITC)等非標記方法發現小分子化合物促使TMV外殼蛋白(CP)盤狀結構(20S)解組裝，抑制病毒的增殖［9-10］。

TMV CP 20S與宿主的致病性和病毒的擴增密切相關，除了保護病毒RNA不被降解外，還參與病毒與宿主之間的應答反應，是抗植物病毒化合物的潛在分子靶標。開展小分子化合物與TMV CP 20S之間的化學生物學教學和實驗對農藥學中的化學生物學的教學探索與創新具有重要的指導作用。

1 理論課教學探索與創新

1.1 農藥學中的化學生物學 在農藥學領域，化學生物學已經成為舉足輕重的一門交叉學科，開展農藥靶標的化學生物學研究，建立一些有結構生物學基礎的農藥分子設計生物模型是農藥學中的重要任務。因此，化學生物學不僅是研究植病過程中農藥基礎的科學，還是研究分子靶標導向的綠色農藥的科學，分子靶標、生物模型是農藥學中化學生物學的關鍵。

1.2 選用合適的參考資料 理論課教學探索與創新的根本來源是選用合適的教材，《化學生物學導論》(馬林主編，化學工業出版社，2006年)、《化學生物學基礎》(劉磊，陳鵬，趙勁主編，生命科學前沿出版社，2010年)、《化學生物學實驗》(曾秀瓊，吳起主編，科學出版社，2013年)是化學生物學方面的主流教材，適合農藥學中的化學生物學教學和實驗使用。同時，可以利用化學生物學專業知名大學如廈門大學、南開大學、清華大學的精品課程資源，化學生物學國內外知名期刊《Nature chemistry》、《Nature chemical biology》、《Nature methods》、《Nature protocol》、《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》、《J.Am.Chem.Soc.》、《Angew.Chem.Int.Ed.》、《J.Agr.Food.Chem.》和《Chembiochem》等發表的相關研究成果也可以作為農藥學中的化學生物學實驗教學探索和創新中的參考資料。

1.3 掌握實驗原理 實驗原理的熟悉程度決定著教師教學的質量和學生接受新知識的能力，是教學創新的支撐點和立足點。凝膠排阻色譜法(SEC)是以被分離物質的分子量差異為基礎的一種層析分離技術，這一技術為判斷生物分子大小提供了一種非常溫和的分離方法［11］。非變性聚丙烯酰胺電泳法(Native-PAGE)是在不加入SDS和疏基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，這一技術為判斷活性蛋白質大分子大小提供了一種有效的驗證方法［11］。等溫滴定量熱技術(ITC)是一種監測由結合成分的添加而起始的任何化學反應的熱力學技術。通過ITC可獲得生物分子相互作用的完整熱力學參數，可以直接測量焓變△H，結合常數Ka，而不對反應體系產生影響，也不引入修飾基團［12］。

1.4 實驗方案設計 一個成功的建筑來源于好的設計方案圖，實驗教學的創新也不例外，讓學生熟練地設計和掌握實驗方案是成功教學的關鍵。

2 實驗課教學探索與創新

2.1 農藥學中的化學生物學實驗現狀分析 化學生物學作為化學領域一門新興的二級學科，在國內一些知名高校中均成立了國家重點實驗室，開展了一些化學生物學實驗課程。國內農藥學中的化學生物學起步相對較晚，僅有一些知名高校開展了農藥學的化學生物學教學任務，如南開大學農藥領域的化學生物學等。貴州大學精細化工研究開發中心擁有“農藥學”國家重點學科、綠色農藥與農業生物工程國家重點實驗室培育基地和教育部重點實驗室，該中心通過用農藥學的理論和方法探索干預和調控植物病菌病害發生發展的途徑和機理，尋找綠色農藥的新先導結構、新作用靶標，開展綠色農藥創制和作用機制研究，該中心非常重視農藥學中的化學生物學這一學科，筆者所在的課題組研究發現一些小分子化合物能夠促使TMV CP 20S解組裝，干預和調控TMV CP 20S與RNA的正常組裝，抑制病毒的增殖。該研究成果作為農藥學中的化學生物學實驗的主要課程之一，對學生理解課本相關理論概念與實驗技能提升有重要作用，對學生的實驗創新具有一定的指導作用。

2.2 開展農藥學中的化學生物學實驗課程 筆者以小分子農藥調控TMV CP 20S的組裝為例，介紹一些在農藥學中的化學生物學實驗教學中需要注意的事項。農藥學中的化學生物學實驗課程是在學完理論課程、學生能夠獨立完成實驗方案設計之后進行的。在動手進行實驗時，需要理解該實驗的原理:通過利用化學生物學研究小分子化合物促使TMV CP 20S解組裝，從而抑制病毒的增殖、干預病毒的侵染能力;掌握實驗用到的化學生物學技術:SEC、Native-PAGE和ITC技術(原理前文已介紹);熟練操作實驗儀器:快速蛋白純化系統和等溫滴定量熱儀;提前準備實驗材料:TMV CP 20S和小分子化合物;實驗過程中隨時記錄實驗數據和利用相關軟件處理實驗數據，最后學生還需要掌握分析實驗數據的能力:如SEC出峰位置與TMV CP 20S分子量大小的關系;N-ative-PAGE條帶大小與TMV CP 20S分子量大小的關系;ITC中對擬合結果的可信值和熱力學參數的分析。將理論課程和實驗結合起來，不但可以提高學生的動手能力，還可以加強學生對理論知識的掌握和理解，達到講授與學習的同步，培養本科生學以致用，用以創新的能力，提升本科生考研和出國深造的能力。

3 結語

農學中的化學生物學經過近幾年的發展逐漸成為一門具有自身特點和內涵的學科，將成為研究植物病毒病害的重要手段和新型高效安全的綠色農藥研究的重要工具。貴州大學精細化工研究開發中心創辦和開展了本科—碩士連讀班，正在開展農藥中的化學生物學實驗等系列精品課程，旨在為培養化學生物學研究型人才奠定基礎。

［1］吳厚銘.化學生物學——新興的交叉前沿學科領域［J］.化學進展，2010，12(4):423-430.

［2］宋寶安，趙德剛，楊松，等.農藥學創新型人才培養體系的構建與實踐［J］.貴州大學學報:自然科學版，2015，31(1):130-135.

［3］席真，陳鵬，劉磊，等.我國化學生物學研究新進展［J］.化學通報，2015，77(7):709-719.

［4］王世敏，宋功武，李玲.化學生物學的科學內涵及其發展［J］.湖北化工，2012(4):1-3.

［5］LI Y M，WANG L，LI S，et al.Seco-pregnane steroids target the subgenomic RNA of alphavirus-like RNA viruses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(19):8083-8088.

［6］GAO S，ZHANG R Y，YU Z，et al.Antofine analogues can inhibit tobacco mosaic virus assembly through small-molecule-RNA interactions［J］.Chembiochem，2012，13(11):1622-1627.

［7］SONG B A，YANG S，JIN L H.Environment friendly anti-plant viral agents［M］.Beijing:Chemical Industry Press，2009:239-241.

［8］CHEN Z，ZENG M J，SONG B A，et al.Dufulin activates HrBP1 to produce antiviral responses in tobacco［J］.PLoS One，2012，7:3944-3949.

［9］李向陽，楊松，宋寶安，等.分子靶標煙草花葉病毒外殼蛋白的結構生物學研究進展［J］.農藥學學報，2010(12):391-340.

［10］LI X Y，SONG B A，HU D Y，et al.A new method to study the mechanism between anti-TMV drugs and the four-layer aggregate disk of TMVCP［C］//4th international symposium on pesticides and environmental safety.Beijing，2012:389-340.

［11］LI X Y，SONG B A，CHEN X，et al.Crystal structure of the four-layer aggregate of engineered TMV CP implies the importance of terminal residues for oligomer assembly［J］.PLoS One，2013，8(11):1-10.

［12］LARSSON E A，JANSSON A，Ng F M，et al.Fragment-based ligand design of novel potent inhibitors of tankyrases［J］.J Med Chem，2013，56(11):4497-4508.