分子標記技術及其在大白菜遺傳育種中的應用

楊林棟

(山西省農業科學院,山西太原 030031)

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分子標記技術及其在大白菜遺傳育種中的應用

楊林棟

(山西省農業科學院,山西太原 030031)

概述了分子標記的基本類型，綜述了近年來分子標記技術在大白菜遺傳多樣性分析、種子純度鑒定、遺傳圖譜構建、基因定位及分子標記輔助選擇育種等方面的研究進展，并對存在的問題和應用前景進行了分析，以期促進分子標記技術能更好地應用于大白菜遺傳育種中。

大白菜；分子標記；遺傳育種

遺傳標記有形態標記、細胞標記、生化標記和分子標記4種類型，是對植物進行遺傳育種研究的得力工具[1]。其中，前3種遺傳標記是對基因的間接反應，是基因差異表達的結果。分子標記則是以DNA為對象而開發的遺傳標記，是核苷酸差異的直接反應，較傳統標記具有明顯的優越性：共顯性，可區別所有的基因型；多態性極高、數量幾乎無限；分析結果不受取材部位和時期的限制；不影響植物進行正常的生命活動，不影響目標性狀的表達。目前DNA分子標記技術已廣泛應用于植物遺傳育種研究中，己成為分子育種的一個重要方向。

大白菜(Brassicacampestrissyn.rapa L.ssp.pekinensis)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，起源于我國，已有五千多年的栽培史，在世界各地廣泛栽培，是人們日常生活中非常重要的蔬菜之一。近年來，隨著分子標記技術的飛速發展，給白菜遺傳育種研究帶來了前所未有的巨大變化，已廣泛應用于大白菜的遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位、種子純度鑒定及分子標記輔助選擇育種等方面，極大地促進了大白菜的新品種選育工作。筆者對分子標記的常用類型和在大白菜育種上的應用情況進行了綜述，以期對大白菜的遺傳育種研究提供一定的參考。

1 常用的分子標記技術

分子標記是對個體在核苷酸水平上的差異進行直接反映。通常將分子標記分為三大類：一是以Southern雜交為基礎的標記技術，如RFLP等；二是以PCR反應為基礎的標記技術，如RAPD、ISSR和SSR等；三是以酶切和PCR相結合的標記技術，如AFLP和CAPS等。目前，大白菜育種常用的主要有RFLP、RAPD、ISSR、SSR和AFLP等標記。

1.1 限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)RFLP 標記是Botstein等[2]在1980年發現的，是最初一代的分子標記，已在植物遺傳育種研究中得到廣泛應用。其基本原理：利用限制性內切酶識別并切割個體的基因組，經PAGE電泳分離后，與特定探針進行Southern雜交，然后再用放射自顯影或其他顯色技術檢測，得到RFLP圖譜。當酶切位點存在差異時，會導致RFLP圖譜的多態性。RFLP 標記是最初一代的分子標記，具有共顯性強、穩定性高等優點，一度成為遺傳育種研究中主要的分子標記工具。隨著PCR技術的誕生和發展，RFLP已逐漸被其他更易檢測、多態性信息含量高的標記所代替。

1.2 隨機擴增多態性(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)Welsh等[3]于1990年以PCR技術為基礎，發展了RAPD分子標記技術。其原理：利用生物基因組中存在大量反向重復序列這一特點，利用單一隨機引物即可將重復序列之間的片段得以擴增，PCR產物經過凝膠電泳及染色即可檢測其多態性。如果引物結合位點發生突變或者擴增片段發生核苷酸的插入/缺失，便可產生多態性。RAPD標記與RFLP標記相比較，具有如下優點：①RAPD標記可在不同物種間共用，通用性極強；②少量的DNA樣品即可滿足RAPD分析的需求；③檢測方便且成本較低。同時RAPD也存在一些缺點：①RAPD標記重復性和穩定性較差，對反應條件極其敏感；②RAPD標記為一顯性標記，無法用于基因型分析。

1.3 內部簡單重復間序列標記 (Inter simple sequence repeat，ISSR)ISSR技術是由加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等[4]于1994年發展的一種新的分子標記技術。其基本原理：SSR簡單重復序列在基因組中廣泛存在，在SSR重復序列的3′ 或5′ 端隨機錨定2～4個隨機的堿基組成擴增引物，長度通常為16～18 bp，通過PCR反應擴增位于2個特定SSR 位點之間的DNA片段。當SSR序列的重復次數發生差異或者錨定位點發生突變時，擴增片段即產生多態性。ISSR標記技術結合了SSR和RAPD技術的優點，穩定性優于RAPD標記，引物的設計成本低于SSR標記，不足之處是ISSR標記為顯性標記，不能進行基因型分析。

1.4 簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)SSR標記又稱微衛星標記，是一類以1～6個核苷酸為基序，經串聯重復而組成的DNA序列，廣泛分布于基因組中。其基本原理：當基序的重復次數不同或者不完全重復時，會導致擴增片段大小差異，從而產生了該位點的多態性。以微衛星兩側的保守序列為依據，設計特異引物，經PCR擴增及PAGE電泳分離，即可獲得SSR位點的多態性[5]。SSR標記與RAPD標記相比，具有如下優點：①SSR標記長度變異很大，多態性豐富；②SSR標記為共顯性標記，可用于基因型分析；③SSR標記是由特異引物擴增的，穩定性及重復性較好。SSR標記的不足之處是開發成本較高，費時、費力。

1.5 擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)Zabeau等[6]于1993年在RFLP和RAPD 2種標記技術的基礎上，發明了AFLP標記技術。其基本原理：利用限制性內切酶酶切基因組DNA，酶切片段在T4DNA連接酶的作用下與特定的接頭連接，形成特異的DNA片段，然后進行預擴增和選擇性擴增。當酶切位點或者選擇性堿基結合位發生突變點時便會形成多態性。AFLP綜合了RFLP和RAPD的優點：少量的DNA樣品即可滿足分析需求，穩定性、可靠性較好，且絕大部分為顯性標記，多態性也很高。不足之處是試驗程序復雜且費用較高，同時對DNA的質量要求較高。

2 分子標記在大白菜遺傳育種中的應用

2.1 遺傳多樣性分析遺傳多樣性是作物進行遺傳改良和新品種選育的基礎。分子標記技術可以克服傳統的以田間表型進行遺傳多樣性分析的缺點，具有多態性高、穩定、客觀等優點，是研究物種遺傳多樣性的有力工具。

Lamboy等[7]、孫德嶺等[8]、郭晶心等[9]利用不同標記技術分析了白菜類蔬菜的親緣關系，結果表明，蕪菁與白菜類蔬菜親緣關系較遠，單獨聚為一類，不結球白菜與大白菜也存在一定的遺傳距離，分別聚為一類。黃寶勇等[10]借助RAPD分子標記技術將11份大白菜種質材料歸類為3種類型：直筒型、直筒與矮樁的過渡型及矮樁型。鄧波等[11]利用AFLP技術對96份白菜種質資源的親緣關系進行研究，結果表明，結球白菜可能存在2種不同的起源方式。宋順華等[12]采用RAPD技術分析了64份大白菜資源的遺傳多樣性，結果表明，大白菜具有較為豐富的遺傳基礎，相似系數最高為0.951，最低為0.681。

利用分子標記技術進行遺傳多樣性分析，與傳統的形態學分類結果有所差異，這可能是由于材料的內在基因表達受限或者表達效應與外在形態關聯不大所引起。利用分子標記進行遺傳多樣性分析，可以同時反映出形態間和表觀不體現的潛在核苷酸差異，分析結果更為準確。

2.2 種子純度鑒定純度和真實性是衡量種子質量的主要標準。傳統的形態鑒定方法易受環境影響且費時、費力，不能達到當年收獲當年用種的要求。DNA指紋圖譜技術是近年來誕生的一種新的檢驗種子純度的方法，依據分子標記技術來進行鑒定，具有簡單、便捷、成本低、多態性位點豐富及不受環境影響等優點，已成為當前進行種子純度鑒定的有力工具。

宋順華等[13]利用AFLP引物組合對90份大白菜材料進行了研究，獲得了一個引物組合E-ACA/M-CTG，該組合可完全區分90份大白菜材料。王笑一等[14]獲得了 80個小白菜品種的指紋圖譜，利用5對引物組合便可將80份小白菜品種完全區分。方淑桂等[15]、管志坤等[16]分別利用RAPD技術和SSR技術進行種子純度研究，獲得了可用于“中熟5號”純度鑒定及“油綠3號”純度鑒定的分子標記。

2.3 遺傳圖譜構建遺傳圖譜是遺傳學研究的有力工具，已經在基因定位、圖位克隆及比較基因組學研究等方面得到廣泛應用，從而提高育種效率。傳統的遺傳圖譜是由形態和生化標記構建的，存在標記數量有限、圖譜密度較低等問題，不能很好地反映基因組的全部情況，應用受到一定限制。由分子標記構建的高密度遺傳圖譜克服了傳統遺傳圖譜的缺點，已廣泛應用于作物遺傳育種研究中。

1991年Song等[17]以大白菜“Michili”和變種“Spring broccoli”為親本，構建了第一張大白菜遺傳圖譜——RFLP圖譜，圖譜全長為1 850 cM，包含10個連鎖群和280個RFLP分子標記位點。Ajisaka等[18]以不同白菜品種間的組合為試材，構建了第一張白菜RAPD分子標記圖譜，包括115個RAPD標記和2個同工酶標記，圖譜長度為860 cM。張魯剛等[19]以大白菜和蕪菁為親本構建了F2定位群體，利用RAPD分子標記技術構建了我國第一張大白菜遺傳圖譜，圖譜具有84個多態性位點，全長1 632.4 cM，平均距離為16.5 cM。盧鋼等[20]以蕪菁與白菜的F2為材料，構建了一張AFLP圖譜，包含了131 AFLP標記和12個連鎖群，全長1 810.9 cM。于拴倉等[21]以大白菜的102份F6重組自交系(NIL)為試材，構建了一張包含87個RAPD標記和265個AFLP標記的圖譜，圖譜全長2 665.7 cM，包含17個連鎖群，平均圖距7.6 cM。王美等[22]以大白菜黃心高感TuMV株系和白心高抗TuMV株系為親本構建了DH系，構建了一張AFLP圖譜，圖譜全長883.7 cM，含255個標記。Soengas等[23]以大白菜F2為作圖群體，利用223個AFLP和23個SSR標記構建了遺傳圖譜，全長664 cM，含10個連鎖群。Choi等[24]利用大白菜自交系“Chiifu-401-42”和 “Kenshin-402-43”為親本構建了一張多標記類型的圖譜，該圖譜全長為1 182 cM，平均圖距2.83 cM，包含10個連鎖群、278個AFLP標記、235個SSR標記、25個RAPD標記及18個EST-STS-CAPS標記。張俊華等[25]以大白菜高抗TuMV-C3的A52-2與高感GCⅣ的自交系為親本構建了一張多標記類型遺傳圖譜，該圖譜全長683.9 cM，平均圖距為5.52 cM，包含12個連鎖群、6個EST-PCR-RFLP標記和118個AFLP標記。張明科等[26]以紫菜薹和大白菜雜交的F2為作圖群體，構建了一張RSAP的遺傳圖譜，全長821.3 cM，平均圖距5.04 cM，含有117個 RSAP、38個SRAP、5個SSR及3個RAPD標記。

2.4 重要性狀的定位及分子標記輔助育種高產、優質、抗病蟲、抗逆等是大白菜選育的主要目標性狀，傳統的選育方法由于主要依據形態標記及生化標記等來進行選擇，結果易受環境條件的影響，所以育種效率往往不高。分子標記輔助選擇(Molecular Marker-Assisted Selection，MAS)就是利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記來對目標性狀進行選擇，與傳統的選擇方法相比，分子標記輔助選擇可以在苗期對目標性狀進行選擇，利用共顯性標記還可以進行基因型選擇，所以分子標記輔助選擇可以大大提高育種效率。

2.4.1與抗病相關的分子標記及基因定位。大白菜具有病毒病、霜霉病和軟腐病三大病害，它們的發生程度直接影響大白菜的產量和品質，抗病育種一直是大白菜育種的一個非常重要的內容。利用分子標記技術發掘、定位抗病相關基因，實現分子標記輔助育種，有利于促進大白菜種質創新及抗病新品種選育。

閆瑾琦[27]、韓和平等[28]利用不同的材料和分子標記方法，分別篩選到了與TuMV緊密連鎖的分子標記，并應用于抗TuMV大白菜的分子標記輔助育種中；張曉偉等[29]獲得了3個TuMV2C4的QTL抗性位點，為TuMV抗性基因的定位、圖位克隆和分子標記輔助育種奠定基礎。冷月強等[30]利用BSA法篩選到一個遺傳距離為6.7 cM的RAPD標記，該標記與霜霉病抗性基因緊密連鎖。Piao等[31]獲得了一個與根腫病基因緊密連鎖的AFLP標記并成功轉化為SCAR標記；陳慧慧等[32]將根腫病抗性基因定位到A3染色體的0.18 cM的區域之內。牟晉華等[33]獲得一個與軟腐病基因緊密連鎖的分子標記，可應用于大白菜的抗軟腐病分子標記輔助育種。孫秀峰等[34]對大白菜干燒心病進行了QTL定位，得到了4個抗性QTLs位點，為干燒心抗病育種奠定了基礎。

2.4.2與耐熱相關的分子標記及基因定位。大白菜喜冷涼氣候，耐熱育種一直是大白菜育種家較為關注的熱點內容之一。鄭曉鷹等[35]以耐熱和感熱材料為親本，獲得了9個與耐熱性相關的分子標記，貢獻率為46.7%。于拴倉等[36]采用復合作圖法，檢測到了5個與大白菜耐熱性相關的QTLs，獲得了5個與耐熱性位點緊密連鎖的分子標記，可應用于耐熱大白菜分子輔助育種。

2.4.3與品質性狀連鎖的分子標記。近年來，隨著人們對蔬菜品質需求的提高，品質育種已成為大白菜育種的一個重要方向。其中，球色育種是大白菜品質育種的一項重要內容。 Matsumoto等[37]通過BSA法獲得了3個與大白菜桔黃心基因緊密連鎖的RFLP標記。王綺等[38]利用SRAP標記技術對大白菜橙色性狀進行了研究，結果表明，該性狀由一對隱性基因控制，同時獲得了一個SRAP標記并轉化為SCAR標記，該標記與橙色基因遺傳距離為3.7 cM，已應用于橙色大白菜的育種中。郁有健等[39]對大白菜紫色性狀進行了QTL定位研究，共檢測到3個QTLs：qp-c1-1、qp-c1-2和qp-c1-3，貢獻率分別為36%、44%和19%，獲得了4個與紫色性狀位點緊密連鎖的分子標記，為紫色白菜的分子輔助育種奠定了基礎。張明科等[40]對大白菜紫色性狀研究，結果表明，大白菜紫色性狀由一對主效基因控制，同時受到微效基因和環境的影響，并獲得了2個與紫色性狀連鎖的RAPD標記，經測序位于白菜的1號染色體。

2.4.4與雄性不育連鎖的分子標記。大白菜品種主要以雜交種為主，主要以雄性不育系進行制種。植物的雄性不育具有細胞質雄性不育、細胞核雄性不育及核質互作雄性不育3種類型。鄧曉輝等[41]、馮冬林等[42]分別以各自的不育系和保持系為材料，均獲得了與胞質雄性不育基因緊密連鎖的標記。Ying等[43]、張慧等[44]采用BSA法均獲得了與大白菜隱性核雄性不育基因緊密連鎖的分子標記，并將其定位于第9號染色體。沈向群等[45]、張淑江等[46]分別以育性分離的F2為分離群體，均找到了與顯性雄性不育系因緊密連鎖的分子標記，并應用于分子標記輔助育種。馮輝等[47]獲得了2個與大白菜核雄性不育復等位基因連鎖的SSR標記，其遺傳距離分別為7.92和4.95 cM，且位于Ms基因同側。

3 問題與展望

分子標記技術的發展，體現了人們對性狀由現象到本質認識的過程。雖然分子標記較其他標記而言具有很多優越性，但自身仍存在一定的缺點，應用受到了一定的限制。檢測技術是DNA多態性能否開發成為遺傳標記的核心技術，隨著分子生物學技術的不斷發展，必定會有更加理想的分子標記技術的出現，從而應用于作物的遺傳育種研究。

迄今，分子標記已經在大白菜的遺傳育種研究中得到廣泛應用，無論是在遺傳多樣性分析、種子純度鑒定，還是遺傳圖譜構建和重要農藝性狀的定位及分子輔助育種等方面均取得了一定的進步，但仍存在一定的問題。首先，與大白菜重要農藝性狀緊密連鎖(如抗逆性)的分子標記數量有限，在一定程度上限制了分子標記輔助育種；其次，不同研究者采用不同的大白菜群體和遺傳標記，導致遺傳圖譜無法相互整合，圖譜密度低、通用較差。隨著大白菜基因組測序工作的完成，必定會為遺傳育種研究提供更多的序列信息，必定會有更多種類和數量的特異性的分子標記開發，從而促進圖譜整合，加快大白菜的育種進程，提高育種效率。

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A Review of DNA Molecular Markers and Its Application in Genetics and Breeding of Chinese Cabbage

YANG Lin-dong

(Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan, Shanxi 030031)

Major types of DNA molecular markers were elaborated, research progress of molecular markers in genetic diversity analysis of Chinese cabbage, identification of seed purity, genetic linkage map construction, gene locating and marker-assisted selection and so on were summarized. In addition, existing problems and application prospect were analyzed, so as to promote better utilization of molecular markers in Chinese cabbage genetic breeding.

Chinese cabbage; Molecular markers; Genetic breeding

楊林棟(1970- )，男，山西應縣人，助理研究員，從事蔬菜方面的研究。

2014-12-22

S 634.1

A

0517-6611(2015)04-030-04