菌落原位雜交技術(shù)在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

丁海燕，馮 偉，李凌智，黃永紅，張 虹 (大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

菌落原位雜交技術(shù)在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

丁海燕，馮 偉，李凌智，黃永紅，張 虹 (大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

微生物技術(shù)在處理環(huán)境污染物等方面具有成本低、無(wú)二次污染、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。為從根本上解決環(huán)境問(wèn)題，就環(huán)境中微生物的檢測(cè)為主題，介紹了菌落原位雜交的原理以及在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。

菌落原位雜交；環(huán)境微生物；檢測(cè)

20世紀(jì)70年代，Pardue 等[1]和 John等[2]成功開發(fā)了原位雜交技術(shù)，他們利用放射性同位素標(biāo)記的 DNA 作探針與爪蟾卵細(xì)胞制片雜交，通過(guò)顯微放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)，檢測(cè)出細(xì)胞與探針互補(bǔ)核酸序列。這是最初的原位雜交技術(shù)，開創(chuàng)了采用分子生物學(xué)技術(shù)研究細(xì)胞遺傳學(xué)的歷史。此后，隨著該項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，原位雜交技術(shù)很快成為醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)的重要技術(shù)[3]。

根據(jù)標(biāo)記物的不同，探針可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針。常用的同位素有32P、35S、3H、125I。同位素標(biāo)記探針具有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是具有放射性，對(duì)人和環(huán)境有傷害。非同位素標(biāo)記探針近年應(yīng)用較廣泛，常用的非同位素標(biāo)記物有熒光素、生物素、地高辛。按照核酸性質(zhì)的不同，又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針。隨著原位雜交技術(shù)的發(fā)展，原位雜交又逐漸細(xì)化為菌落原位雜交和組織原位雜交。筆者介紹了菌落原位雜交的原理以及在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 菌落原位雜交基本原理

菌落原位雜交的過(guò)程是將瓊脂平板中培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)置于硝酸纖維素濾膜上，然后使培養(yǎng)的菌落裂解釋放出其中的DNA，烘干DNA固定在膜上，和標(biāo)記的探針雜交，用放射自顯影或熒光顯微鏡等方法檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。

組織原位雜交通常簡(jiǎn)稱為原位雜交，主要是指組織或細(xì)胞層次的原位雜交。菌落原位雜交與組織原位雜交的不同是：菌落原位雜交需要裂解細(xì)菌釋放出DNA，與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交；組織原位雜交是通過(guò)酶解等方法改變組織細(xì)胞的透過(guò)性，讓探針能夠進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)與待檢測(cè)核酸序列雜交[4]。

目前，原位雜交技術(shù)多種多樣，如熒光原位雜交技術(shù)、基因組原位雜交技術(shù)等。但對(duì)于環(huán)境中存在的微生物進(jìn)行測(cè)試時(shí)，菌落原位雜交仍是最常用的方法。

2 菌落原位雜交在環(huán)境微生物多樣性診斷中的應(yīng)用

長(zhǎng)期以來(lái)，純培養(yǎng)一直是研究環(huán)境微生物的主要方法，由于環(huán)境微生物中能被培養(yǎng)出來(lái)的只有很小一部分，只有 非常少的微生物能被分離和鑒定，所以進(jìn)行微生物多樣性分析時(shí)，其結(jié)果通常是有局限性的。在不同環(huán)境微生物研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，高達(dá)99%以上的微生物不能通過(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)[5]，由于核酸序列能夠提供遺傳距離、分子雜交探針等信息，可用于自然生態(tài)系統(tǒng)中微生物的鑒定[6]。環(huán)境微生物與菌落原位雜交技術(shù)的結(jié)合，對(duì)于環(huán)境微生物組成、結(jié)構(gòu)與功能的研究有極大幫助，尤其是具有特殊分層結(jié)構(gòu)，多樣化代謝菌群共存與協(xié)同偶合等特性的顆粒污泥，對(duì)于深層次了解環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)、種群的關(guān)系和處理效率的相關(guān)性，進(jìn)一步提高廢水處理效率具有極重要的理論和實(shí)用意義。利用菌落原位雜交技術(shù)研究自然環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道很多，如海水沉積物[7]的群落，高山湖雪水[8]的浮游菌體，海水[9]和河水[10]的群落特征，土壤[11]和根系表面[12]的寄居群落。此外，新的種屬或一些未被培養(yǎng)的種屬鑒定，菌落原位雜交技術(shù)發(fā)揮了重要作用。菌落原位雜交技術(shù)[13-14]在探索菌群的生態(tài)學(xué)成分，以及外界條件對(duì)群落的動(dòng)態(tài)影響方面均是非常有力的技術(shù)手段。

3 菌落原位雜交在污水微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

1914年，Ardern 和 Lockett發(fā)明了活性污泥污水處理方法。人們通過(guò)檢測(cè)特異底物的轉(zhuǎn)化率，如耗氧速率、磷吸收和釋放、硝化、反硝化、Fe3+的還原等方法，研究活性污泥中重要功能菌群的活性[15]。而菌落原位雜交技術(shù)的應(yīng)用可以完整地展現(xiàn)出菌落的空間排列順序，數(shù)量的多少等一系列信息，所以利用菌落原位雜交和放射自顯影技術(shù)研究廢水處理系統(tǒng)中微生物的數(shù)目、活性和對(duì)特異底物的消耗，效果顯著。

3.1 硝化細(xì)菌微生物中硝化細(xì)菌和氨氧化菌的數(shù)目與空間分布嚴(yán)格限制硝化和反硝化過(guò)程所處的階段，因此在調(diào)控廢水脫氮的運(yùn)行工藝中，生物處理系統(tǒng)中硝化細(xì)菌和氨氧化菌的研究極為重要。硝化細(xì)菌是一類化能自氧菌，傳統(tǒng)的研究方法耗時(shí)長(zhǎng)，要經(jīng)過(guò)富集、分離、分類和鑒定等步驟，又因所用的培養(yǎng)基有選擇性，使某些易于培養(yǎng)的菌株，如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacter winogradskyi等超過(guò)了其他硝化細(xì)菌，這樣得到的優(yōu)勢(shì)類群與樣品真實(shí)情況有明顯差異。菌落原位雜交技術(shù)的引入解決了上述難題。通過(guò)人工設(shè)計(jì)合成的硝化細(xì)菌和氨氧化菌探針，對(duì)污水污泥中硝化細(xì)菌的多樣性采用菌落原位雜交法進(jìn)行了跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)許多具有優(yōu)勢(shì)的硝化菌加以培養(yǎng)后，真正實(shí)現(xiàn)了工業(yè)污水、廢水的硝化處理。

3.2 除磷細(xì)菌除磷脫氮工藝在廢水處理工程中已被廣泛應(yīng)用，特別是強(qiáng)化除磷(EBPR)工藝，對(duì)污水的除磷效果尤為顯著。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)不同除磷工藝中聚磷菌的生態(tài)變化進(jìn)行了分子雜交分析。菌落原位雜交技術(shù)的應(yīng)用克服了除磷菌難以用常規(guī)方法培養(yǎng)的困難，對(duì)生物除磷工藝的改進(jìn)起到了指導(dǎo)性作用。

3.3 難降解有機(jī)物功能降解菌近年來(lái)，大量學(xué)者將原位分子雜交技術(shù)應(yīng)用于功能降解菌的生態(tài)變化研究中，克服了功能降解菌用常規(guī)方法培養(yǎng)的困難，真正開創(chuàng)了一個(gè)有效利用生物降解的綠色時(shí)代。

4 小結(jié)

盡管菌落原位雜交技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物群落分子生態(tài)研究中還存在一些問(wèn)題，如同位素的放射性對(duì)人體的傷害，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)等，但因其高度的靈敏性和準(zhǔn)確性，仍受到許多科研人員的歡迎，并廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)、菌落定位等研究領(lǐng)域。環(huán)境微生物學(xué)的研究可以從菌落原位雜交技術(shù)中得到大量信息，且隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，菌落原位雜交的準(zhǔn)確性和靈敏度將進(jìn)一步提高，必將在環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域得到更加充分的應(yīng)用，對(duì)工業(yè)廢水的污染控制作出貢獻(xiàn)

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Application of Colony in situ Hybridization in Detection of Environmental Microorganisms

DING Hai-yan, FENG Wei, LI Ling-zhi et al

(School of Biological Engineering, Daqing Normal University, Daqing, Heilongjiang 163712)

Microbial technology in the treatment of environmental pollutants has the advantages of low cost, no two pollution, mild reaction conditions etc. In order to fundamentally solve the environmental problems, this paper introduces the principle of colony in situ hybridization and its application in the environmental detection of microorganism.

Colony in situ hybridization; Environmental microorganism; Detection

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12513004)；大慶師范學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目(12ZR04)。

丁海燕(1973- )，女，黑龍江大慶人，副教授，從事生物技術(shù)研究。

2015-03-27

S 188；X 172

A

0517-6611(2015)14-025-02