水霉菌感染鯉誘導氧化應激發生的研究

黃建　湯茜　姚卓鳳　張俊梅　顧澤茂　袁軍法

摘要：以感染水霉病的鯉（Cyprinus carpio）為研究對象，測定了患病鯉血漿中氧化應激相關指標，包括總抗氧化能力（T-AOC）、脂質過氧化產物-丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化氫酶（CAT），同時隨機取患病組鯉的肝胰臟、脾臟和腎臟組織進行組織病理分析，旨在探討氧化應激同水霉菌致病機理的關聯。結果表明，①患病組相對于對照組，魚體血漿T-AOC極顯著降低（P<0.01）；MDA含量和GSH含量無顯著變化；SOD和CAT活性極顯著降低（P<0.01）；GPx活性顯著升高（P<0.05），表明鯉患水霉病后魚體內氧化水平-抗氧化水平失衡，魚體產生氧化應激。②組織病理學分析顯示患水霉病鯉的肝臟細胞相對于對照組出現嚴重的急性壞死癥狀，細胞出現空泡化現象嚴重；脾臟和腎臟細胞出現不同程度的炎癥，細胞開始凋亡。

關鍵詞：水霉病；鯉（Cyprinus carpio）；氧化應激；組織病理

中圖分類號：S965.116；S941.43+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5677-05

Abstract：In this study， plasma from diseased or healthy common carps （Cyprinus carpio） was collected to evaluate the effect of infection with Saprolegniasis on oxidative stress. Several bio-chemical markers of oxidative stress， including the total antioxidant capacity （T-AOC），lipid peroxidation- malondialdehyde （MDA），superoxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH），glutathione peroxidase （GPx），and catalase （CAT） were measured among controls and infected common carps. Compared with the healthy common carps，some biomarkers of the common carps infected with Saprolegniasis， including T-AOC，SOD and CAT，were decreased significantly （P<0.01），and the plasma GPx was increased significantly （P<0.05）. Other biomarkers of plasma MDA and GSH showed no significant change after the infection with Saprolegniasis. These results indicated that oxidative stress has occurred upon Saprolegniasis infection. The histopathology damage of liver， spleen， and kidney tissues from diseased fish were also observed after hematoxylin and eosin （HE） staining. Liver cells of common carps infected with Saprolegniasis was presented with the symptom of acute necrosis， and became vacuolization seriously；spleen and kidney cells was presented with inflammations of different severity，senescence and apoptosis.

Key words：Saprolegniasis；common carp（Cyprinus carpio）；oxidative stress；histopathology

水霉病（Saprolegniasis）由寄生于水生魚類體表及卵上的真菌引起，現已成為水產養殖業的主要疾病之一，對水產養殖業造成巨大的經濟損失[1]。常見的種類主要是卵菌綱（Oomycetes）水霉目（Saprolegniales）水霉科（Saprolegniaceae）的一些成員，包括水霉屬（Saprolegnia）、綿霉屬（Achlya）、絲囊菌屬（Aphanomyces）[2，3]。患病水生魚類食欲減退、行動呆滯；頭部、吻端、尾部、軀干或鰭條，甚至鰓部有水霉菌寄生，并黏附污泥和藻類，其狀如覆蓋棉絮，故俗稱“白毛病”。在魚卵孵化過程中，該病也經常發生，內菌絲侵入卵膜內，叢生大量外菌絲，為“卵絲病”。被寄生的魚卵，內外菌絲呈放射狀，有“太陽子”之稱[4]。在生產中一直以孔雀石綠治療該病，療效較好，但孔雀石綠具有高毒性、高殘留、高致癌和致畸性。2002年中華人民共和國農業部發布的193號公告以及NY5072-2002標準《無公害食品漁用藥物使用準則》中明確規定在漁業領域禁用孔雀石綠，但目前還缺乏安全有效的替代藥物[5]。

水霉菌溫度適應范圍廣，分布范圍大，無宿主特異性[6]。當魚類體表受傷或者免疫力降低、水溫驟變等時，水霉菌寄生在傷口處，通過傷口吸收營養，將菌絲侵入到肌肉、真皮等組織，造成組織壞死，從而誘發水霉病[7]。研究表明，感染水霉菌后可上調促炎相關因子的表達[8]；也有研究表明，水霉菌感染大西洋鮭后可抑制先天性免疫相關基因的表達，從而使魚體產生嚴重的炎癥[9]。

氧化應激是微生物感染導致的組織損傷的病理機制之一[10，11]，氧化應激和炎癥在維持機體穩態的免疫反應過程中密切相關[12]。氧化應激參與了肥胖、癌癥、衰老和腫瘤等病理過程[13，14]，阻斷氧化應激的發生，成為對抗微生物感染和減少組織損傷的新思路[15，16]。氧化應激是指當機體遭受有害刺激時，體內活性氧自由基和活性氮自由基產生過多，氧化程度超過抗氧化物質的清除能力，導致機體內氧化抗氧化水平失衡[17]。關于魚類感染微生物誘導氧化應激發生的報道很少，僅見石斑魚神經壞死病毒（Grouper nervous necrosis virus，RGNNV）和草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染誘發氧化應激反應的報道[18，19]。鯉春病毒血癥病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）感染可誘導氧化應激[20，21]。為此，本研究通過測定感染水霉菌的鯉血漿中氧化應激相關指標，并結合患病魚的組織病理學分析，初步探討了鯉水霉病誘發氧化應激及其介導的病理變化，為水霉病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚類 健康鯉和患水霉病鯉取自華中農業大學水產學院實驗教學基地。

1.1.2 試驗試劑 總抗氧化能力T-AOC檢測試劑盒（碧云天S0116）、脂質過氧化產物-丙二醛MDA檢測試劑盒（碧云天S0131）、超氧化物歧化酶SOD檢測試劑盒（南京建成A001-1）、還原性谷胱甘肽GSH檢測試劑盒（南京建成A006-1）、過氧化氫酶CAT檢測試劑盒（南京建成A007-1）、谷胱甘肽過氧化物酶GPx檢測試劑盒（南京建成A005），波恩試液購自武漢博洪生物科技有限公司，組織病理切片由武漢谷歌生物科技有限公司制作。

1.2 方法

1.2.1 患病鯉體表水霉菌絲的顯微觀察 用鑷子輕輕刮取患病鯉體表水霉菌絲置于培養皿中，用70%乙醇漂洗3 s，用無菌水沖洗2次，然后用微吸管吸取水霉菌絲置于載玻片上顯微鏡觀察。

1.2.2 患水霉病鯉和健康鯉血漿氧化應激指標的測定 采集患病組和對照組鯉的全血（加肝素鈉抗凝）4 ℃ 2 500 r/min，離心得到血漿，分別測定血漿總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）、脂質過氧化產物-丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion peroxidase，GPx）活性。具體測定方法按照試劑盒說明書進行，結果以SPSS（17.0）進行Duncan法單因素ANONA分析。

1.2.3 患病鯉的組織病理學分析 隨機取患病組和對照組的鯉各3尾，分別取其肝胰臟、腎臟和脾臟組織固定于波恩試液（飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1，V/V/V）中，以常規法制作石蠟切片，并進行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理變化。

2 結果與分析

2.1 患病鯉體表水霉菌絲的形態觀察

患病鯉體表水霉菌絲為透明管狀結構，中間無橫隔，分枝較少，菌絲細長（圖1A）。其游動孢子囊多呈棒狀，游動孢子發育成熟后從孢子囊頂端釋放出來， 并迅速游離（圖1B）。

2.2 患水霉病鯉和健康鯉血漿氧化應激指標的測定

測定魚體的氧化及抗氧化系統兩方面的指標來評估鯉遭受水霉菌感染后是否誘發氧化應激。患水霉病鯉與健康鯉相比，血漿總抗氧化能力T-AOC極顯著降低（P<0.01），超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT活性極顯著降低（P<0.01），谷胱甘肽過氧化物酶GPx活性顯著升高（P<0.05），還原型谷胱甘肽GSH含量無顯著變化，脂質過氧化產物-MDA含量無顯著變化，鯉感染水霉菌后機體抗氧化水平極顯著降低，氧化水平無顯著變化（表1）。結果表明，鯉遭受水霉菌侵襲后機體的氧化-抗氧化系統失衡，遭受氧化應激脅迫，可能同其致病性相關。

2.3 組織病理學觀察

與對照組相比，患水霉病鯉肝臟組織細胞細胞質溶解，細胞界限模糊，出現嚴重的急性壞死癥狀，細胞空泡化現象嚴重（圖2A、圖2B）；腎小球腫脹，間質細胞核變大，染色質凝集，細胞嗜堿性增強，腎小管上皮細胞的細胞核變大，部分腎小球結構喪失（圖3A、圖3B）；脾臟組織細胞出現嗜中性粒細胞炎癥，未成熟紅細胞處于衰老狀態，含鐵血黃素逐漸形成（圖4A、圖4B），腎臟和脾臟組織出現不同程度的炎癥和衰老癥狀，細胞開始凋亡。

3 小結與討論

微生物感染能引起氧化應激的發生，如風疹病毒（Rubella virus，RV）[22]、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）[23]以及白色念珠菌（Candida barbicans）[24]和炭黑曲霉菌（Aspergillus carbonarius）[25]等，這些研究都表明微生物感染機體后會產生大量ROS。機體的抗氧化應激信號通路會被激活，產生抗氧化物質，用于清除ROS，避免機體因過度氧化損傷導致的死亡。如細菌內毒素（Lipopolysaccharides，LPS）可以通過產生大量活性氧ROS，誘導轉錄激活因子ATF3（Activating transcription factor3，ATF3）的上調來抑制高遷移率族蛋白B1（High-mobility group protein B1，HMGB1）的表達以保護機體[26]。若機體內氧化-抗氧化系統的失衡，會導致ROS在胞內的積聚，產生氧化應激，最終造成脂質、蛋白質和DNA等生物大分子的損傷。氧化應激作為微生物感染的致病機理之一，參與了許多疾病的病理過程。

本試驗測定了患病鯉的氧化應激相關指標，表明鯉在感染水霉菌后也誘發了氧化應激。衡量機體氧化應激狀態有兩方面，一方面是氧化水平，主要包括活性氧自由基（Reactive oxygen species， ROS）、活性氮自由基（Reactive nitrogen species， RNS）、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity， T-AOC）、脂質過氧化產物-丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、蛋白質氧化損傷產物-蛋白質羰基含量和DNA氧化損傷產物-8-OHdG等；二是抗氧化水平，主要包括抗氧化酶類-超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion peroxidase，GPx）和過氧化氫酶（Catalase，CAT），非酶類抗氧化劑-還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、維生素E和維生素C等[27]。患水霉病鯉與健康鯉相比，血漿總抗氧化能力T-AOC極顯著降低，超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT活性極顯著降低，谷胱甘肽過氧化物酶GPx活性顯著升高，還原型谷胱甘肽GSH含量無顯著變化；脂質過氧化產物-MDA含量無顯著變化。鯉感染水霉菌后遭受不同程度的氧化損傷，由于DNA和蛋白的氧化損傷，合成抗氧化酶類的機制受損[28]，從而使超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT活性極顯著降低，最終造成總抗氧化能力T-AOC極顯著降低。抗氧化水平的降低，又進一步加重組織細胞損傷[29]。谷胱甘肽過氧化物酶GPx活性顯著升高，可能是代償性升高，由于氧化應激的產生激活核轉錄因子NRF2，從而導致下游抗氧化基因的表達，避免組織細胞遭受過度氧化損傷[30，31]。GPx能降解脂質過氧化物，防止細胞脂質過氧化損傷，在GPx作用下脂質過氧化產物轉化為較為穩定的羥基化合物（ROH），阻斷了脂質過氧化的自由基鏈式反應，從而導致脂質過氧化產物-丙二醛的含量沒有顯著性變化[32]。GPx在清除ROS和脂質過氧化的過程需要將大量的還原型谷胱甘肽氧化成氧化型谷胱甘肽GSSG，機體為了保證充足的底物供應，在谷胱甘肽還原酶的作用下，將GSSG還原成GSH，因而GSH含量無顯著性變化[33]。水霉菌感染鯉后機體的氧化-抗氧化系統失衡，抗氧化水平極顯著降低，不能有效清除機體內產生的ROS，機體產生了氧化應激[34]。

組織病理學分析表明，感染水霉菌的鯉呈現出明顯的病理變化，其中腎臟和脾臟細胞出現不同程度的炎癥和衰老癥狀，細胞開始凋亡。炎癥反應能促進ROS的產生，同時激活相關炎性細胞，導致相關促炎因子的表達，并且ROS也能激活NF-κB，從而上調各種炎癥介質和促炎因子的表達。ROS在機體內的蓄積誘導氧化應激的發生，造成機體嚴重的氧化損傷，又進一步加重了機體的炎癥反應[12]。細胞凋亡在機體生長發育和衰老等許多生理和病理過程中有著重要作用，研究發現氧化應激能通過多種途徑誘導細胞凋亡的發生[35]。組織病理變化分析表明水霉菌感染鯉機體后產生嚴重的炎癥反應，可能是由于機體產生氧化應激激活了核轉錄因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB），NF-κB調控機體炎癥反應，能夠上調各種炎癥介質和相關促炎因子的表達，其中環氧合酶2（Cyclooxygenase -2，COX-2）的表達上調又可以合成前列腺素E2（Prostaglandin E2）來介導炎癥病理過程[8，9，36，37]。患病鯉組織出現的細胞凋亡也與氧化應激密切相關，氧化應激產生的ROS的蓄積導致NF-κB的活化也能夠誘導細胞凋亡[35]。NF-κB的活化能夠促進相關促炎因子的表達，從而激活絲裂原活化蛋白激酶細胞凋亡信號通路[38]，誘導細胞凋亡的發生。氧化應激指標測定結果表明，感染水霉菌的鯉機體抗氧化水平極顯著降低，不能有效清除機體產生的ROS，造成機體內ROS的蓄積，誘發了氧化應激，同時組織病理學分析表明機體產生了嚴重的炎癥反應和細胞凋亡現象。這些都說明水霉菌感染鯉后產生大量的ROS，機體遭受氧化應激脅迫，造成機體組織細胞氧化損傷[39]。

鯉感染水霉菌后，氧化應激的產生誘導了炎癥和細胞凋亡的發生，共同介導了其病理過程，因此，可以通過阻斷氧化應激的發生來預防和治療真菌感染，通過提高機體的抗氧化水平來清除機體內產生的大量ROS，從而避免組織細胞遭受過度的氧化損傷，并且也能一定程度上緩解炎癥反應和細胞凋亡的發生。如在水產養殖中，通過添加抗氧化劑，可增強魚體的抗氧化能力。后續將進一步評價抗氧化劑或抗氧化應激信號通路的激活劑抵抗水霉菌的作用[20，40]。

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（責任編輯 屠 晶）