構(gòu)樹皮總黃酮提取及抗菌活性研究

開偉華，寇婉青，程 正，錢世兵，陳葉平

（1．銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 銅陵 244000；安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥 230012；3．銅陵市食品藥品檢驗所，安徽 銅陵 244000）

構(gòu)樹（Broussonetiapapyrifera（L．）Vent．）為桑科構(gòu)屬喬木，雌雄異株，又名谷漿樹、楮桃樹、沙紙樹。構(gòu)樹的藥用價值很高，其根、皮、葉、漿、果實和種子均可入藥，具有抗氧化、抗血小板凝聚、降壓、抗腫瘤、增強免疫和抑菌等作用［1］。其中，構(gòu)樹的抑菌作用一直受到人們的關(guān)注，如《本草綱目》云：“去風(fēng)濕腫脹，癬瘡。”《圣惠方》記載：“治癬濕癢不可忍，構(gòu)樹葉半斤，細切，搗令極爛，敷于癬上。”

構(gòu)樹皮又名楮樹皮，性味甘平，能祛風(fēng)、活血、利尿，可用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、虛腫、皮炎等。構(gòu)樹皮的化學(xué)成分主要為黃酮類、二苯丙烷類化合物以及香豆素、萜類、生物堿、脂肪油等［2－4］，黃酮類成分是構(gòu)樹皮多類化學(xué)成分中的主要成分，可作為特征性成分對其提取物進行表征。本研究采用正交設(shè)計法優(yōu)化構(gòu)樹皮黃酮最佳提取工藝，并采用大孔吸附樹脂富集構(gòu)樹皮總黃酮，比較不同洗脫部位抑菌效果，尋找構(gòu)樹皮有效的抑菌活性部位。

1 材料

1．1 藥品與試劑 構(gòu)樹皮：安徽亳州中藥材市場；98%槲皮素對照品：Sigma Aldrich；AB－8大孔樹脂：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三氯化鋁（分析純）：Sigma Aldrich；其他試劑均為分析純。紅色毛癬菌、白色念珠菌：安徽銅陵市食品藥品檢驗所微生物室提供。

1．2 主要儀器 T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；電子分析天平：Shimadzu；鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2．1 測定波長的選擇［5－7］取構(gòu)樹皮粗提物適量，精密稱定，加甲醇使溶解，搖勻，制成含10mg／mL構(gòu)樹皮提取物溶液，作為供試品溶液。另取105℃干燥至恒質(zhì)量的槲皮素對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成0．1mg／mL槲皮素溶液，作為對照品儲備液。精密量取槲皮素對照品儲備液和供試品溶液各1．0mL，分別加入1%三氯化鋁甲醇溶液各1 mL，搖勻，放置15min后，在200～600nm波長范圍內(nèi)進行掃描，以不加槲皮素標準液為空白，記錄掃描圖（見圖1）。樣品在270nm處的最大吸收峰和槲皮素吸收峰的重合度好，因此選擇270nm為測定波長。

2．2 標準曲線繪制 精密量取槲皮素對照品儲備液0、0．5、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0mL，分別置10mL具塞試管中，各加入1%三氯化鋁－甲醇溶液1mL，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，以不加槲皮素標準液為空白，于270nm波長下測定吸光度，得出標準曲線A＝0．027C＋0．004 9，r＝0．999 8，說明槲皮素含量在0～50μg／mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2．3 構(gòu)樹皮總黃酮提取 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末10．0g，加入不同體積倍數(shù)的乙醇，采用超聲處理，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑濃縮至干，得到構(gòu)樹皮粗提物。分別稱取構(gòu)樹皮粗提物，配置成10mg／mL供試品溶液，精密量取供試品液各1．0mL，分別加入1%三氯化鋁甲醇溶液各1mL，搖勻，放置顯色15 min后，由回歸方程求出稀釋液中總黃酮類化合物濃度，計算出構(gòu)樹皮總黃酮提取率。總黃酮提取率按下式計算：總黃酮含量＝（總黃酮量／浸膏量）×100%。

采用L9（34）正交試驗設(shè)計，選用不同的乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時間（C）、超聲功率（D）為試驗因素，優(yōu)化超聲法提取構(gòu)樹皮總黃酮最佳工藝參數(shù)，具體因素水平安排見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2．4 構(gòu)樹皮總黃酮富集 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末100．0g，按最佳提取工藝，超聲提取，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑至無醇味，濃縮液過濾后加水稀釋為0．5g／mL生藥溶液，按照藥液－樹脂比約1∶5上AB－8大孔吸附樹脂，依次以蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度洗脫，分別收集各流分，回收溶劑至干，分別得到30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位，按照“2．3”項下方法操作，自“加1%三氯化鋁甲醇溶液”起，依法測定吸收度，計算出不同洗脫部位中總黃酮含量。

2．5 構(gòu)樹皮不同活性部位體外抑菌作用試驗［8－9］選用紅色毛癬菌和白色念珠菌，用平皿藥基法［10－11］，以沙堡瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別取30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位濃縮提取物0．1g溶于適量水中，置100mL量瓶中，用滅菌雙蒸餾水稀釋至刻度。精密量取藥液0．1mL加入8mL瓊脂培養(yǎng)基中混勻，用滅菌雙蒸餾水稀釋成不同濃度，以溶劑及其基礎(chǔ)為對照，用菌懸液法配成相當(dāng)于0．5麥氏濁度的菌懸液備用，接種，培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（26±1）℃，時間為7d，觀測抑菌效果。

3 結(jié)果

3．1 構(gòu)樹皮總黃酮提取試驗 正交試驗結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。由方差分析結(jié)果可知，總黃酮提取優(yōu)選工藝條件為A2B1C2D3，而從極差看出影響總黃酮含量的主要影響因素為乙醇濃度和超聲時間，從節(jié)約能源角度確定總黃酮提取最佳工藝為A2B1C1D1，即以10倍體積70%乙醇冷浸，超聲20min，功率300W，總黃酮提取率最高。由表3可知，因素A對提取工藝有顯著性影響，因素B、C、D對提取工藝的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。

3．2 構(gòu)樹皮總黃酮驗證試驗 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末10．0g，按最佳工藝重復(fù)做3次，測得總黃酮含量平均值為2．18%。

表2 構(gòu)樹皮總黃酮的L9（34）正交試驗結(jié)果

3．3 驗證試驗 稱取構(gòu)樹皮干燥粉末10．0g，按最佳工藝重復(fù)做3次，測得總黃酮含量平均值為2．18%。

3．4 構(gòu)樹皮總黃酮富集分離 對得到的各乙醇洗脫部位測定總黃酮含量，結(jié)果見表4。總黃酮含量：70%乙醇洗脫部位＞50%乙醇洗脫部位＞30%乙醇洗脫部位＞90%乙醇洗脫部位。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

表4 構(gòu)樹皮各部位總黃酮含量

3．5 構(gòu)樹皮各部位體外抑菌試驗 構(gòu)樹皮提取物30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位提取物對紅色毛癬菌和白色念珠菌均有一定的抑制作用，70%乙醇洗脫部位抑菌作用最強，50%乙醇洗脫部位次之，30%乙醇洗脫部位和90%乙醇洗脫部位抑菌作用最差，這與各部位總黃酮含量呈對應(yīng)關(guān)系。見表5。

表5 不同濃度乙醇洗脫部位雙蒸餾水液的抑菌作用

4 討論

淺部真菌病是皮膚科臨床最常見的皮膚病，是由寄生于角蛋白組織的致病真菌所引起的皮膚病。致病菌主要為皮膚癬菌，其次為淺部念珠菌，感染人體后可引起組織反應(yīng)而發(fā)生紅斑丘疹、水皰、鱗屑、斷發(fā)、脫發(fā)和甲板改變等。目前，針對淺部真菌病的治療，己開發(fā)了多種口服和外用抗真菌藥物。化學(xué)藥物具有一定的抗真菌作用，但由于真菌感染率的不斷增加，真菌耐藥菌株日益增多，加之化學(xué)藥物的毒性和不良反應(yīng)以及耐藥性的產(chǎn)生，使得化學(xué)藥物治療難度不斷增大，這種現(xiàn)狀迫切要求人們不斷尋找高效低毒的抗真菌藥物。因此，從中草藥中有效地提取、篩選抗真菌活性成分，尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌藥物已成為一個重要的研究方向［12］。

構(gòu)樹因其耐旱、耐濕、耐冷、萌芽力強，在自然界中有很強的適應(yīng)性，在我國黃河兩岸、大江南北、平原山區(qū)隨處可見，資源非常豐富。本研究通過對構(gòu)樹皮總黃酮的提取、純化以及不同洗脫部位的體外抑菌試驗，確定構(gòu)樹皮最佳提取工藝為：取構(gòu)樹皮粉末，以10倍體積的70%乙醇為溶劑，超聲提取20 min，功率300W，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至無醇味，再經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂富集，依次以蒸餾水、30%、50%、70%和90%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部位，濃縮至干，即得。該工藝操作簡單、耗能低、總黃酮提取率高，對淺部真菌紅色毛癬菌和白色念珠菌均有良好的抑制作用，為進一步開發(fā)抑菌活性強、質(zhì)量可控、性質(zhì)穩(wěn)定且毒性和不良反應(yīng)小的抑制淺部真菌制劑奠定了基礎(chǔ)。

（銅陵市食品藥品檢驗所管大平對構(gòu)樹原料進行了鑒定，銅陵市食品藥品檢驗所微生物室提供了菌種，謹致謝意！）

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